УДК: 61:578.7;616-07:061.62
Год издания: 2000

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСОВ

Марьянкова Р.Ф.Счесленок Е.П.Владыко А.С.
Рубрики: 76.03.41
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Создать коллекцию рекомбинантных плазмид в рамках Национальной коллекции вирусов, патогенных для человека».
Сроки выполнения НИР: 1998-1999 гг.
Научный руководитель: проф. И.С. Лукашевич.

Для сохранения генофонда патогенов особо опасных вирусов проводится работа по получению рекомбинантных ДНК, содержащих в составе плазмидных векторов нуклеотидные последовательности отдельных генов (или их участков) вирусов, патогенных для человека. Клонирование генов вирусов, высокопатогенных для человека, позволяет проводить исследования без использования специальных защитных технологических линий.

Получены двухцепочечные кДНК генов, кодирующих белок NP вируса лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ), GPC вируса Ласса и участок М сегмента вируса Хантаан, с использованием реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR). В качестве матрицы выступала суммарная фракция РНК вируса ЛХМ, Ласса и Хантаан в количестве около 6 мкг.

В качестве вектора для кДНК гена NP вируса ЛХМ использовали плазмиду рс KNP. Эта плазмида содержит уникальные сайты для ферментов рестрикции и гены устойчивости к ампициллину и неомицину. Перед реакцией лигирования вектор и фрагмент кДНК подвергался обработке ферментами рестрикции Bam HI и Hind III для образования липких концов. Таким образом, была сконструирована рекомбинантная плазмида: pc KNP/NP LCM, содержащая фрагмент гена NP вируса ЛХМ.

Для кДНК гена GPC вируса Ласса была использована плазмида pcDNA3. При помощи RT-PCR и соответствующих праймеров был синтезирован кДНК фрагмент гена GPC вируса Ласса размером 2000 н.п. Рекомбинантная плазмида (pcDNA3/GPC Lassa) была сконструирована с использованием метода лигирования по липким концам.

При конструировании рекомбинантной плазмиды, содержащей участок М сегмента вируса Хантаан, был использован метод АТ-клонирования. При этом плазмидный вектор обрабатывался Т7 ДНК-полимеразой, образующей свободные Т-сайты на 3' конце молекулы ДНК-вектора. В последующем такой вектор был лигирован с продуктом ПЦР, который на 3' концах несет свободный аденозин (А), присоединенный термостабильной ДНК-полимеразой.

Для подтверждения наличия вставок генов NP, GPC и G2 в векторах pcDNA3, pcKNP и pCR II (соответственно) выделенную из полученных клонов плазмидную ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазами BamHI, Hind III для pc DNA3/GPC Lassa, pcKNP/NP LCM и Eco RI для pCR II/G2 HAN и анализировали в 1,5% агарозном геле, используя в качестве маркера DNAIII и ДНК фага l. Результаты электрофоретического анализа показали, что получена линейная ДНК плазмиды рсDNA3 и вирусспецифический фрагмент ДНК размером 2000 н.п., соответствующий гену белка GPC вируса Ласса. Рекомбинантная плазмида KNP содержала вирусспецифическую вставку NP вируса ЛХМ (1300 н.п.). Электрофоретический анализ рекомбинантной плазмиды pCR II подтвердил наличие вставки гена G2 размером 365 н.п.


Область применения: НИР, сохранение генофонда особо опасных вирусов.
Рекомендации по использованию: рекомбинантные плазмиды могут быть использованы при производстве диагностических препаратов.
Предложения по сотрудничеству: имеем возможность выполнить заказ по получению рекомбинантных плазмид.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта