В инфекционной патологии человека хламидиоз играет важную роль. Передаваясь в основном половым путем, хламидии являются причиной широкого круга разнообразных по локализации и клиническому течению труднодиагностируемых и трудноизлечиваемых заболеваний. В практическом здравоохранении диагноз хламидиоза ставится на основании анамнеза, оценки клинических признаков болезни и лабораторных методов исследования. Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством обнаружения антигена Сhlamydia trachomatis в культуре клеток МсСоу, обработанных циклогексимидом. Другой подход состоит в выявлении морфологических структур хламидий (элементарных и ретикулярных телец) в содержимом соскобов из уретры и цервикального канала в реакции иммунофлуоресценции. Последняя в непрямом варианте используется и для обнаружения специфических противохламидийных антител (IgM, IgG и sIgA). Наши исследования были направлены на разработку отечественной диагностической тест-системы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК хламидий в клиническом материале от больных острыми и хроническими урогенитальными инфекциями, что является импортозамещающей и валютосберегающей разработкой.

Основой разработанной тест-системы являются специфические олигонуклеотиды (праймеры): прямой - 5' GGG CGT GTA GGC GGA AAG G 3' и обратный - 5' CCC AAC AAC TCA CGG CAC G 3', кодирующие фрагмент ДНК С. trachomatis, состоящий из 496 пар оснований (позиции 580-1076). Нами отработана технология получения праймеров фосфитным методом с использованием автоматического ДНК-синтезатора ABI-380В (США), выделения ДНК хламидий из клинического материала, режим постановки ПЦР и анализ продуктов амплификации.

В качестве положительного контроля К+ в тест-системе используется ДНК оригинального авторского штамма C. trachomatis, штамм МТ-2, выделенного из соскобного материала из уретры от больной хроническим хламидиозом в 1999 году (депонирован в Национальную коллекцию вирусов и бактерий Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ, номер государственной регистрации: НКВ-№Х3-2). Накопление возбудителя проводили в культуре клеток МсСоу (множественность инфицирования 2ґ10⁶ ТЦД₅₀/мл). Выделение бактериальной ДНК осуществляли экстракцией фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом (25:24:1) по общепринятой методике.

Основным свойством диагностической тест-системы является ее способность выявлять ДНК C. trachomatis в клиническом материале. После проведения ПЦР амплифицированные ДНК-продукты C. trachomatis обнаруживают путем фракционирования электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Наличие специфического фрагмента генома определяют с помощью контрольной ДНК исследуемого возбудителя, амплифицированной одновременно с клиническим материалом. Результат считается положительным, если размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту положительной контрольной пробы, и отрицательным, если в пробе, содержащей клинический материал, специфических ДНК-продуктов не обнаруживают.

Диагностические возможности разработанной тест-системы были испытаны при исследовании соскобного материала из уретры и цервикального канала здоровых людей, больных с лабораторно подтвержденным диагнозом хламидиоз и больных с урогенитальной патологией неясной этиологии. Для сравнения полученных данных применяли прямую реакцию иммунофлуоресценции с использованием тест-системы «ХламиСкан» (ЛабДиагностика, РФ) и культуральный метод («золотой стандарт»).

Исследования показали, что тест-система для диагностики хламидийной инфекции в ПЦР выгодно отличалась от используемых на практике подходов повышенной чувствительностью и специфичностью. Электрофоретический анализ продуктов амплификации клинических образцов от больных хламидиозом в 100% случаев показал наличие синтезируемых мажорных ДНК-продуктов ожидаемого размера 0,5 kb. Контрольные образцы, не содержащие хламидий, дали в ПЦР с данной парой праймеров отрицательные результаты. Среди обследованных с урогенитальной патологией неясной этиологии хламидийная инфекция выявлена у 55,2% больных, тогда как другими методами хламидиоз обнаруживали значительно реже. В ПЦР у здоровых лиц хламидийное носительство не было установлено ни в одном случае.

На диагностическую тест-систему подготовлена нормативно-техническая документация: Лабораторный регламент на производство диагностической тест-системы для выявления ДНК Сhlamydia trachomatis в полимеразной цепной реакции «Хлами-ПЦР» и инструкция по ее применению.