Токсины энтеробактерий являются видоспецифическими белками с определенной биологической активностью и антигенными свойствами. Они могут быть использованы при разработке диагностикумов для выявления продуктов жизнедеятельности возбудителей в биологическом материале.

Цель работы - выделение, очистка и исследование некоторых биологических свойств экзотоксина Y. pseudotuberculosis.

В качестве продуцента экзотоксина использовали бактерии Y. pseudotuberculosis штамм 1 серовар 3 (благодарим проф. Г.Я. Ценеву, Санкт-Петербургский институт Пастера).

Бактерии культивировали в селективной среде (Yersinia Selective Enrichment Broth, Merck, Германия) во флаконах в течение 24 ч при 37° С. Бактериальную культуру центрифугировали при 5500 g в течение 30 мин, супернатант фильтровали через стерильный фильтр GS-0,22 мкм (Millipore, США). Токсин осаждали высаливанием сульфатом аммония до 70% насыщения, осадок отделяли центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин, перерастворяли в буфере, содержащем 0,1 моль трис-HC, рН 7,4, диализовали против того же буфера. Диализат наносили на колонку (1,6x60 см) с сефадексом «Superdex 200». Элюцию токсина проводили тем же буфером. Для определения молекулярной массы белка колонку калибровали стандартными белками с известной молекулярной массой.

Наличие токсина во фракциях выявляли по цитотоксической активности на культуре перевиваемых клеток Vero, FL и L41(Диалек). Материал, содержащий токсин, наносили на монослой перевиваемых клеток в лунках бактометра (BioMerieux Vitek Inc) и фиксировали бактометрический показатель динамики их роста (максимум изменений, %).

Материал, содержащий токсин, подвергали прогреванию при 100° С (10 мин в кипящей «водяной бане»), хранению в течение 30 дней при температуре +4° С, а также при -20° С и затем оценивали его цитотоксическую активность параллельно со свежевыделенным (нативным) материалом.

Нативный токсин полностью подавлял жизнедеятельность монослоя всех трех линий перевиваемых клеток. При 4-кратном разведении материала, содержащего токсин, для Vero график роста приближался к контрольному (без токсина), для FL и L41 наблюдалось существенное (до 30%) снижение максимума изменений. Данная тенденция намечалась уже в первые 5-6 ч наблюдения.

В таблице представлены результаты титрования цитотоксической активности на культуре клеток FL проб нативного токсина параллельно с обработанными при различных температурах.

Приведенные результаты показывают, что нами получен экзотоксин возбудителя псевдотуберкулеза, сохраняющий свои цитотоксические свойства при воздействии высоких и низких температур.

При гель-фильтрации белков, входящих в состав сконцентрированного высаливанием и диализом токсина Y. pseudotuberculosis, профиль элюции был представлен 4 белковыми фракциями. Молекулярная масса белка, элюирующего в 1-й фракции, составляла 368,52 кДа, во 2-й фракции - 26,49 кДа, в 3-й - 5,26 кДа, в 4-й фракции элюировались низкомолекулярные компоненты. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали белки, содержащиеся в 1-й и 3-й фракциях.

Титрование цитотоксической активности экзотоксина Y. pseudotuberculosis на культуре перевиваемых клеток FL

Таким образом, из Y. pseudotuberculosis, выращенной в жидкой накопительной питательной среде в течение 24 ч при 37° С, выделен термостабильный экзотоксин, обладающий цитотоксическим эффектом на перевиваемые культуры клеток.