УДК: 579.842.23
Год издания: 2001

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКЗОТОКСИНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Титов Л.П.Ермакова Т.С.Паньшина Е.Ф.Тумило Т.А.
Рубрики: 76.03.41
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать технологию получения корпускулярных диагностикумов для ускоренной серодиагностики бактерий кишечной группы».
Сроки выполнения НИР: 2001-2005 гг.
Научный руководитель: чл.-кор. НАНБ, д-р мед. наук, проф. Л.П. Титов.
Соисполнители: Институт физиологии НАНБ.

Токсины энтеробактерий являются видоспецифическими белками с определенной биологической активностью и антигенными свойствами. Они могут быть использованы при разработке диагностикумов для выявления продуктов жизнедеятельности возбудителей в биологическом материале.

Цель работы - выделение, очистка и исследование некоторых биологических свойств экзотоксина Y. pseudotuberculosis.

В качестве продуцента экзотоксина использовали бактерии Y. pseudotuberculosis штамм 1 серовар 3 (благодарим проф. Г.Я. Ценеву, Санкт-Петербургский институт Пастера).

Бактерии культивировали в селективной среде (Yersinia Selective Enrichment Broth, Merck, Германия) во флаконах в течение 24 ч при 37° С. Бактериальную культуру центрифугировали при 5500 g в течение 30 мин, супернатант фильтровали через стерильный фильтр GS-0,22 мкм (Millipore, США). Токсин осаждали высаливанием сульфатом аммония до 70% насыщения, осадок отделяли центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин, перерастворяли в буфере, содержащем 0,1 моль трис-HC, рН 7,4, диализовали против того же буфера. Диализат наносили на колонку (1,6x60 см) с сефадексом «Superdex 200». Элюцию токсина проводили тем же буфером. Для определения молекулярной массы белка колонку калибровали стандартными белками с известной молекулярной массой.

Наличие токсина во фракциях выявляли по цитотоксической активности на культуре перевиваемых клеток Vero, FL и L41(Диалек). Материал, содержащий токсин, наносили на монослой перевиваемых клеток в лунках бактометра (BioMerieux Vitek Inc) и фиксировали бактометрический показатель динамики их роста (максимум изменений, %).

Материал, содержащий токсин, подвергали прогреванию при 100° С (10 мин в кипящей «водяной бане»), хранению в течение 30 дней при температуре +4° С, а также при -20° С и затем оценивали его цитотоксическую активность параллельно со свежевыделенным (нативным) материалом.

Нативный токсин полностью подавлял жизнедеятельность монослоя всех трех линий перевиваемых клеток. При 4-кратном разведении материала, содержащего токсин, для Vero график роста приближался к контрольному (без токсина), для FL и L41 наблюдалось существенное (до 30%) снижение максимума изменений. Данная тенденция намечалась уже в первые 5-6 ч наблюдения.

В таблице представлены результаты титрования цитотоксической активности на культуре клеток FL проб нативного токсина параллельно с обработанными при различных температурах.

Приведенные результаты показывают, что нами получен экзотоксин возбудителя псевдотуберкулеза, сохраняющий свои цитотоксические свойства при воздействии высоких и низких температур.

При гель-фильтрации белков, входящих в состав сконцентрированного высаливанием и диализом токсина Y. pseudotuberculosis, профиль элюции был представлен 4 белковыми фракциями. Молекулярная масса белка, элюирующего в 1-й фракции, составляла 368,52 кДа, во 2-й фракции - 26,49 кДа, в 3-й - 5,26 кДа, в 4-й фракции элюировались низкомолекулярные компоненты. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали белки, содержащиеся в 1-й и 3-й фракциях.

Титрование цитотоксической активности экзотоксина Y. pseudotuberculosis на культуре перевиваемых клеток FL

Содержание токсина (мг) в 1 мл среды Максимум изменений, %
Токсин
нативный
Токсин обработанный
1000° С
10 мин
+4° С
(хранение 30 дней)
-20° С
(хранение 30 дней)
Контроль 18,8
0,01 15,9 14,0 16,9 14,4
0,02 12,4 15,2 14,6 11,0
0,04 9,1 9,0 8,7 7,6
0,08 6,7 9,8 2,1 4,9
0,16 3,2 5,4 0,8 3,1
0,32 2,1 2,6 0,2 2,7

Таким образом, из Y. pseudotuberculosis, выращенной в жидкой накопительной питательной среде в течение 24 ч при 37° С, выделен термостабильный экзотоксин, обладающий цитотоксическим эффектом на перевиваемые культуры клеток.


Область применения: микробиология.
Рекомендации по использованию: выделенный экзотоксин Y. pseudotuberculosis может быть использован при разработке иммунодиагностикума.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта