В связи с недостаточным производством коммерческих препаратов для диагностики арбовирусных инфекций, возбудители которых циркулируют на территории республики, встала необходимость разработки диагностических тест-систем на основе штаммов арбовирусов, имеющихся в коллекции лаборатории экологии и эпидемиологии арбовирусных инфекций ГУ НИИ ЭМ.

Нами разработаны тест-системы для определения антител класса М и G к вирусам Западного Нила (ЗН) и Тягиня непрямым методом флуоресцирующих антител (нМФА) в сыворотке крови и ликворе больных людей. Основой тест-систем является антиген, содержащийся в фиксированных клетках перевиваемой культуры BGM, зараженной вирусами (ЗН и Тягиня соответственно). Основным свойством тест-системы является способность выявлять антитела класса М и G в ликворе и сыворотке крови больных за счет свойств антигена специфически связываться с гомологичными антителами. Выявление связавшихся с антигенами антител проводится с помощью антивидовой сыворотки, меченной флуоресцеинизотиоционатом (иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих) и содержащей антитела к иммуноглобулинам М и G (IgM и G) человека. Учет реакции проводят с помощью люминесцентного микроскопа.

Тест-система выпускается в комплекте с реагентами, необходимыми для постановки нМФА и соответствующими положительными и отрицательными контролями. Препарат с антигенсодержащими клетками представляет собой предметное стекло, содержащее 8 лунок с зараженными клетками. В качестве положительного контроля используется иммунная асцитическая жидкость (ИАЖ), содержащая антитела (IgM и IgG) к вирусу, которая получена путем иммунизации белых мышей вируссодержащей суспензией. Отрицательным контролем служит асцитическая жидкость (АЖ), не содержащая антител к вирусам. Также в комплект входят иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие против IgM и IgG белых мышей и иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие против IgM и IgG человека, которые представляют собой антитела, меченные флуоресцеинизотиоционатом (коммерческие препараты НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва).

На первом этапе работы проводили восстановление штаммов вирусов. Для этого готовили 10% вируссодержащую суспензию из мозга и заражали ею белых мышей. На высоте проявления клинических признаков заболевания животных умерщвляли, извлекали мозг и готовили вируссодержащую суспензию на среде ДМЕМ, которую использовали для инфицирования клеток BGM. Инкубировали 4–5 сут при температуре +37° С. Микроскопировали ежедневно, отмечая специфическую цитодеструкцию. Далее определяли инфекционную активность полученной вируссодержащей культуральной суспензией.

Для получения антигенсодержащих препаратов инфицировали монослой 2-суточной культуры клеток BGM и инкубировали при температуре +37° С. После появления первых признаков вирусной цитодеструкции (24–36 ч) монослой клеток переводили в суспензию и доводили их концентрацию до 3 млн/мл. Полученную суспензию инфицированных клеток наносили в лунки предметных стекол, фиксировали ледяным ацетоном и обеззараживали под ультрафиолетовыми лампами.

ИАЖ, содержащие IgM и IgG к вирусам ЗН и Тягиня, получали путем иммунизации белых мышей вируссодержащей суспензией по разработанной нами схеме иммунизации. При накоплении достаточного количества асцитической жидкости производили ее забор путем пункции брюшной полости. Для получения АЖ, не содержащей антител к вирусам, иммунизацию осуществляли нормальной мозговой суспензией, приготовленной из мозга здоровых белых мышей. Качество и специфичность ИАЖ контролировали в РСК.

Разработанные нами тест-системы для экспресс-диагностики арбовирусных инфекций, вызываемых вирусами ЗН и Тягиня, позволяют диагностировать эти заболевания в короткие сроки и ускорить постановку этиологического диагноза, учитывая многообразие симптомов проявления арбовирусных инфекций.