Целью исследования была разработка методики исследования цитотоксичности свободных и иммобилизованных гепатотропных препаратов с использованием изолированных гепатоцитов. Гепатоциты получали от крыс-самцов линии Вистар массой 200–250 г. Гепатоциты выделяли с помощью раствора коллагеназы типа I. Использовали суспензии с количеством жизнеспособных гепатоцитов >85%. Суспензию клеток (0,5×10⁶ клеток/мл) пассировали в покрытые коллагеном 12-луночные культуральные плашки и инкубировали при 37° С в атмосфере с 5% СО₂. Через 2 ч культивирования среду заменяли новой и добавляли исследуемые препараты. Выраженность некроза оценивали по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в культуральной среде. Активность общей ЛДГ оценивали после обработки монослоя гепатоцитов 0,1% раствором тритона Х-100. Морфологическое выявление некроза гепатоцитов осуществляли путем окраски клеток пропидиум йодидом с последующей флуоресцентной микроскопией. Апоптоз исследовали по фрагментации ДНК методом электрофореза. Через 4 ч инкубации гепатоцитов (0,5×10⁶ клеток/мл) с препаратами клетки промывали холодным фосфатным буфером, лизировали смесью, содержащей 100 ммоль/л Трис-HCl (рН 8,0), 200 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л ЭДТА и 0,2% додецилсульфата натрия, и механически снимали с плашек. Затем к гепатоцитам добавляли протеиназу К (20 мг/мл) и смесь инкубировали в течение ночи при 56° С. ДНК экстрагировали дважды смесью из фенола хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1), промывали 70% этанолом, высушивали, суспензировали в 10 ммоль Трис-HCl и обрабатывали рибонуклеазой А (10 мг/мл) в течение 30 мин при 37° С. Электрофорез ДНК (5 мкг) осуществляли в 1,5% агарозном геле, окрашенном SYBR Green II при 35 V в течение 4 ч. Наличие апоптоза оценивали по межнуклеосомной фрагментации ДНК. Морфологические признаки апоптоза выявляли путем определения конденсации хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа после окраски гепатоцитов Hoechst 33342. Подсчитывали 500 клеток и количество апоптотических клеток выражали в процентах.

Предложенный метод оценки цитотоксичности был использован при сравнительном исследовании препаратов свободных и иммобилизованных урсодезоксихолевой, тауроурсодезоксихолевой кислот в диапазоне концентраций 50–1000 мкг/мл.