Появление новой аппаратуры для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) значительно расширило возможности очистки белков с целью создания диагностических тест-систем.

На первом этапе выполняли качественный анализ с целью выделения нейроспецифических белков группы S100 из мозгового аутопсийного материала (не более 2 ч с момента смерти). Исследование включало гомогенизацию мозговой ткани в 0,01 моль фосфатном буфере с добавлением твина-80, рН 8,0 и ступенчатое высали вание сульфатом аммония при 60 и 100% насыщении последнего, обессоливание на колонке с сефадексом G50 (1,5 × 100 см), разделение обессоленных проб на отдельные фракции на колонке с Toyopearl HW-50 (1,0 × 100 см). Контроль предварительной очистки проводили путем электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

На следующем этапе очищенные вышеописанным способом белковые фракции в объеме 20 мкл наносили на колонку Zorbax 300 SB-C18 (4,6 × 150 мм) жидкостного хроматографа «Agilent-1100». Белки элюировали в градиенте концентрации ацетонитрила и 0,02 моль фосфатного буфера, рН 7,0 (5 мин — 0–25%; 7,5 мин — 25–45%) при скорости потока 1000 мл/мин и температуре 30° С. Элюат контролировали спектрофотометрически при длине волны 280 нм, нужные фракции объединяли. Выход основной белковой фракции наблюдали на 9,5 мин.

В качестве контрольных материалов использовали коммерческие препараты S100β и смесь S100α+S100β (производство «Sigma», США). В результате хроматографического разделения белка S100β выявлен один пик (9,5 мин), а смеси S100α+S100β — три пика (9,3; 9,5 и 10,8 мин). Таким образом, подтверждается время выхода основной белковой фракции (S100β) на хроматограмме при разделении опытного материала. Второй (9,3 мин) и третий (10,8 мин) пики на хроматограмме смеси S100α и S100β обусловлены, вероятно, наличием S100α и консервантов в коммерческом препарате.

Предполагается использовать высокоочищенные препараты НСБ группы S100 для создания иммуноферментных тест-систем для определения антител к нейроспецифическим белкам группы S100 как маркеров повреждения гематоэнцефалического барьера.