УДК: 61.61:578.7
Год издания: 2003

РАЗРАБОТКА УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММА ВИРУСА ГЕПАТИТА А

Орлова С.В.Петкевич А.С.Рогачева Т.А.Кретов С.Ф.Заикина Т.Н.Рустамова Л.М.
Рубрики: 76.03.41
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Выделение штамма вируса гепатита А, эндемичного для Республики Беларусь».
Сроки выполнения НИР: 1999–2001 гг..
Научный руководитель: канд. биол. наук С.В. Орлова.

Цель работы — выделение и характеристика эндемичного для Республики Беларусь штамма вируса гепатита А (ВГА) и адаптация его к различным клеточным линиям.

Учитывая длительный и нецитолитический цикл репликации, был определен круг пермиссивных культур клеток и условия их длительного культивирования. Были испытаны 5 линий клеток FRHK, 4647, BGM, VERO и ФЭЧ.

Для выделения вируса отбирали пробы от людей, контактирующих с больными ГА, и от больных ГА. Методом ИФА обследовано 534 экстракта от больных и 306 от контактных лиц. У больных в 6,7% случаев (35 человек) обнаружен антиген с индексом активности до 5,0, что соответствует низкой концентрации вируса, и в 4% (5 человек) обнаружен антиген с высокой концентрацией. Исследование экстракта фекалий контактных лиц показало, что процент проб с высоким содержанием антигена составил 5,6%, а с низким — 14,3%. Поэтому забор материала в инкубационном периоде обеспечивал большую вероятность обнаружения антигена с высоким уровнем активности.

Известно, что выделение ВГА из клинического материала больных затруднено в связи с биологическими особенностями возбудителя: вирус размножается, как правило, без цитодеструкции и в процессе репродукции не ингибирует синтез макромолекул клетки-хозяина. Очень часто устанавливается персистентная инфекция.

Выход вируса в клетках низкий и обычно не превышает 100 ТЦД 50/мл. Поэтому следует подобрать специальный режим и приемы адаптации для повышения эффективности выделения штамма. Кроме того, режим адаптации предусматривает подбор условий длительного культивирования клеток, обеспечивающий цикл репродукции вируса и перевод возможно персистентной формы в цитодеструктивную.

Для этого были изучены различные условия заражения, предусматривающие время и температуру адсорбции, различный состав питательных сред. Применяли метод предобработки трипсином, позволяющий облегчить проникновение вируса в клетку. И безсывороточное культивирование клеток за сутки до заражения для возможного уменьшения синтеза клеточных протеаз в нарезании полипептидов. Антиген вируса определяли в ИФА.

В процессе адаптации антигена ВГА из экстрактов фекалий в клеточных культурах были выделены изоляты на FRHK, VERO, 4647 и ФЭЧ. Для получения стабильной репродукции выделенных изолятов проводили их пассирование на клеточных линиях выделения. При последующих заражениях клеточных линий выделенными изолятами отмечалось размножение вируса на клетках в течение 5 пасажей изолятов, выделенных на 4647. При пассировании этих изолятов отмечалось менее интенсивное размножение от пассажа к пассажу. На FRHK регистрировали продукцию антигена в течение 3–4 пассажей. На VERO удалось выделить вирус только при исходном заражении (1 пассаж), закрепить его на 2 и 3 пассажах не удалось. На клетках BGM в данных условиях культивирования вирус не размножался. Подтверждения принадлежности выделенных изолятов к ВГА проводили в модифицированной РН путем нейтрализации антигена специфическими антителами в конкурентном ИФА. В качестве стандарта специфических антител использовали фракцию иммуноглобулина, выделенную из сыворотки больного ГА, в стадии отдаленной реконвалесценции. В парных сыворотках взятых в острой, продромальной и стадии реконвалесценции отмечено нарастание титра общих антител. Иммуноглобулин, выделенный из сыворотки больного, и сыворотка были использованы в конкурентном ИФА. Для двух изолятов, полученных на диплоидных клетках эмбриона человека (ФЭЧ), и для изолята, полученного на 4647, показана в РН их принадлежность к ВГА.


Область применения: вирусология, инфекционные заболевания.
Рекомендации по использованию: результаты могут быть использованы при экспериментальных исследованиях медико-биологических свойств вируса, а также при получении антигена и вакцины.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по проблеме.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта