![]() |
УДК: 615.012:615.316.018.46
Год издания: 2004
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ КРИОКОНСЕРВИРУЮЩИХ СОСТАВОВ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ СОХРАННОСТИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ
Рябцева Е.С., Кривенко С.И., Усс А.Л., Завгородняя И.Л., Дрык С.И.
Рубрики: 76.29.33
Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови
Тема НИР: «Разработать стандартные технологические протоколы получения, сепарации, замораживания и хранения в криобанке кроветворных клеток пуповинной крови человека на основе использования отечественных препаратов и материалов с целью создания Национального банка
Сроки выполнения НИР: январь 2002 г. — декабрь 2003 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук С.И. Кривенко, д-р мед. наук А.Л. Усс.
Цель исследования — оценка сохранности гемопоэтических стволовых клеток в образцах пуповинной крови (ПК) при длительном хранении в криобанке при использовании различных криоконсервирующих составов с содержанием диметилсульфоксида (ДМСО) в замораживающей смеси не более 5%.
Про организации банка ПК одним из важнейших вопросов является обеспечение гарантии качества трансплантата при его длительном хранении, что во многом определяется правильным подбором режима замораживания и криопротекторов. Наиболее распространенным является метод с введением ДМСО в концентрации 10% от конечного объема замораживающей смеси. В наших экспериментах этот вариант постановки был использован в качестве контрольного.
Одновремено нами были апробированы криоконсервирующие составы, состоявшие из 5% ДМСО с добавлением 5% альбумина или 5% аутоплазмы (в перерасчете на конечный объем замораживающей смеси).
Для оценки качества образцов в процессе хранения были сформированы 4 серии (3 мес., 6 мес., 9 мес., 1 год). По прошествии вышеозначенных интервалов времени образцы ПК были разморожены. Клетки были исследованы на жизнеспособность в стандартном тесте с трипановым синим. Изменение пролиферативного и дифференцировочного потенциала гемопоэтических клеток в процессе хранения оценивалось по их способности к формированию колоний в полутвердых метилцеллюлозных культурах in vitro с использованием тест-системы «Stemline™ Complete Methylcellulose Medium» (Sigma, США).
При использовании в качестве криопротектора ДМСО в концентрации 10% (контроль) в исследованных сериях не отмечалось снижения жизнеспособности ядросодержащих клеток (ЯСК) в процессе хранения (см. табл. 1).
Таблица 1
Оценка жизнеспособности ЯСК ПК в процессе длительного хранения
Способ криоконсервирования | Срок хранения | |||
3 | 6 | 9 | 12 | |
ДМСО 10% | 94,14 ± 0,65 | 96,0 ± 0,0 | 95,16 ± 0,33 | 96,25 ± 0,25 |
ДМСО 5% + альбумин 5% | 96,29 ± 0,32 | - | 96,12 ± 0,27 | 96,0 ± 0,0 |
ДМСО 5% + аутоплазма 5% | 92,0 ± 0,47 | - | 93,0 ± 0,21 | - |
При использовании ДМСО в пониженных концентрациях (но не менее 5% от конечного объема) с добавлением альбумина не отмечалось существенного снижения жизнеспособности клеток в процессе хранения, а сохранность клеток была сопоставима с таковой при использовании 10% ДМСО. Введение в криоконсервирующую смесь 5% аутологичной плазмы было несколько менее эффективно, но в целом обеспечивало достаточно высокий уровень сохранности ЯСК (жизнеспособность не ниже 91%) (см. табл. 1).
Что касается пролиферативного и дифференцировочного потенциала гемопоэтических клеток, то в процессе хранения кроветворные предшественники сохраняли нормальный уровень колониеобразования со стандартным для использованной тест-системы распределением по росткам кроветворения (см. табл. 2).
Таблица 2
Пролиферативная активность гемопоэтических клеток ПК в процессе длительного хранения
Способ криоконсервирования | Уровень колониеобразования в культуре | |||
КОЕк | БОЕэ | КОЕ-ГМ | КОЕсм | |
ДМСО 10% | 58,59 ± 0,35 | 16,28 ± 0,22 | 35,35 ± 0,27 | 7,06 ± 0,11 |
ДМСО 5% + альбумин 5% | 58,83 ± 0,37 | 16,13 ± 0,25 | 36,03 ± 0,24 | 6,68 ± 0,14 |
ДМСО 5% + аутоплазма 5% | 52,27 ± 0,52 | 12,35 ± 0,30 | 33,12 ± 0,53 | 6,89 ± 0,15 |
Использование вышеуказанных составов с уменьшением содержания ДМСО в криоконсервирующей смеси практически не оказывало влияния на пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников ПК. Наблюдалось некоторое снижение уровня колониеобразования в вариантах использования криоконсервирующей смеси с 5% аутологичной плазы преимущественно за счет эритроидного ростка, однако данное изменение не носило характера статистически значимой зависимости.
Полученные результаты позволяют рекомендовать для замораживания и хранения образцов ПК криоконсервирующие составы на основе пониженных концентраций ДМСО (но не менее 5% от конечного объема), дополненные альбумином или аутоплазмой.
Область применения: трансплантация гемопоэтических клеток.
Рекомендации по использованию: способ консервации с использованием криоконсервирующих составов на основе пониженных концентраций ДМСО, дополненных альбумином или аутоплазмой, внедрен в практику в Республиканском центре трансплантации костного мозга и может быть использован для длительн
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по вышеуказанной тематике.