Диагностика кишечных инфекций является значимой клинической и эпидемиологической проблемой. Имеются сведения о твердофазном иммуноанализе изолированных антигенов с использованием маркеров, полученных с применением коллоидного золота. Интенсивная окраска золотосодержащего маркера позволяет непосредственно проводить визуальное определение продуктов иммунохимической реакции на твердом носителе, что может быть использовано при разработке диагностикумов для ускоренной серологической диагностики бактерий кишечной группы.

Цель работы — получение меченных частицами коллоидного золота антител к энтеробактериям для дальнейшего конструирования технологичных и доступных диагностикумов для обнаружения антигенов Escherichia coli O157:H7.

Источником специфических антител служили кроличьи гипериммунные сыворотки к О- и ОН-антигенам. Специфическую активность полученных сывороток контролировали в реакции непрямой гемагглютинации и реакции иммунодиффузии по общепринятой методике Оухтерлони. В работе использовали сыворотки с титром антител от 1:16 до 1:10240. Иммуноглобулиновую фракцию получали традиционным способом путем двукратной обработки сыворотки насыщенным раствором сульфата аммония с последующей гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25.

В качестве растворимых антигенов использовали липополисахариды, изолированные из клеток E.coli O157:H7, и белково-полисахаридный антиген. Суспензии микроорганизмов инактивировали кипячением на водяной бане в течение 30 мин с последующим контрольным высевом на специфическую стерильность.

Золи золота получали методом химической конденсации, используя реакцию восстановления золотохлористо-водородной кислоты (ЗХВК). В качестве восстановителей использовали борогидрид натрия и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стеклянную посуду тщательно отмывали последовательно: механически; детергентом; «царской водкой»; деионизированной водой. Водные растворы 0,01%-ной ЗХВК, 0,5%-ного борогидрида натрия, 3 x 10^–4 моль динатриевой соли ЭДТА готовили непосредственно перед их применением. Для всех растворов использовали деионизированную воду. Все растворы фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore, США).

О размере частиц коллоидного золота судили по величине и положению максимума оптической плотности, которые определялись с помощью стандартного спектрофотометра СФ-26. Было получено коллоидное золото с размером частиц 5–40 нм, изучены его оптические свойства, зависимости спектрального положения и величины максимума экстинкции.

Конъюгацию золя с зондом, количество которого определяли исходя из «золотого числа», проводили смешиванием на магнитной мешалке. Через 2–3 мин вносили вторичный стабилизатор. При конъюгировании золей с антителами экспериментально регистрируется небольшое увеличение максимума поглощения. На рис. 1 представлены спектры ослабления экстинкции коллоидного золота, конъюгированного с антителами в концентрации 1, 5, 10 мкг/мл золя.

Рис. 1. Спектры ослабления экстинкции конъюгатов золота с антителами в концентрации 1, 5 и 10 мкг/мл

Для золей со средним размером частиц 5 нм, содержащих различные концентрации ЗХВК, определены спектры ослабления в диапазоне длин волн 340–740 нм. Наиболее общая модель, включающая полидисперсность размеров и формы, согласуется с экспериментом. По нашим экспериментальным данным, для крупных частиц (24 и 40 нм) длинноволновая часть экспериментальных спектров была несколько шире.

Полученные конъюгаты антител с коллоидным золотом будут использованы при разработке и изготовлении диагностикумов для ускоренной серологической диагностики бактерий кишечной группы.