УДК: 577.156.1 : [ 616.98 : 579.871.1
Год издания: 2005

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА

Никандров В.Н.Пыжова Н.С.
Рубрики: 76.03.41
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: Изучить набор внутри- и внеклеточных протеиназ у токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae и взаимосвязь их с токсигенностью
Сроки выполнения НИР: 2002-2004
Научный руководитель: доктор биол. наук, проф. В.Н.Никандров
Соисполнители: госбюджет

Одним из неясных аспектов взаимоотношения токсиногенеза и протеолитических про-цессов у Corynebacterium diphtheriae является обнаруженная протеолитическая активность у образцов дифтерийного токсина, в т.ч. закристаллизованных (Роре, 1957). Ранее мы устано-вили, что образцы дифтерийного токсина с электрофоретической гомогенностью не менее 95% не обладали собственной фибринолитической активностью и не активировали прочно сорбированный на фибрине плазминоген, хотя медленно активировали водорастворимый плазминоген (Никандров, Пыжова, 2003).

Принимая во внимание, что фибриноген является субстратом, наиболее трудно гидроли-зируемым внутриклеточными протеиназами коринебактерий дифтерии штамма PW-8, и что внеклеточные фибринолитические протеиназы обнаруживаются лишь при культивировании штаммов на питательных средах, обогащенных белками сыворотки крови, т.е. в неблагопри-ятных для токсиногенеза условиях (Никандров и соавт., 2002, 2004), мы изучили действие очищенных образцов дифтерийного токсина на расщепление нескольких белков субстратов.

Образцы дифтерийного токсина были выделены нами из супернатанта культуральной жидкости штамма PW-8 методом солевого фракциорирования и адсорбционной хроматогра-фии и имели токсичность, определенную на монослойных культурах фибробластов эмбрио-нов кур LD50=1,31 нг/мл. Методом лизиса фибриновых и белок-агаровых пластин (концентрация белка 10 г/л, агар-агара – 10 г/л) установлено, что в присутствии 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 образ-цы дифтерийного токсина при концентрации 1мг/мл способны расщеплять фибриноген, же-латин, сывороточный альбумин быка:

Белок субстрат Площадь зоны лизиса (мм2)
в тонком слое (n=4)
Фибриноген 130 ± 9
Желатин 154 ± 7
Сывороточный
альбумин
105 ± 10

Крайне важный вопрос заключался в том, не является ли подобная протеолитическая ак-тивность следствием загрязнения протеиназами микроорганизма.

Оказалось, что протеолитическая активность образцов токсина на всех субстратах полно-стью блокировалась добавками нитротетразолиевого синего (10-2 М), но была мало чувстви-тельна к остальным перехватчикам супероксидного радикала (адреналин, супероксиддисму-таза), к соединению ароматической природы - HO-Q, к перехватчикам .ОН-радикала (маннит, формиат), к перехватчикам синглетного кислорода (азид натрия, триптофан, гистидин, ме-тионин). В частности, эффект последних проявлялся лишь при расщеплении сывороточного альбумина и не превышал 25% подавления активности.

Вместе с тем, эффект группоспецифических ингибиторов протеиназ (фенилметил-сульфонилфторида, р-хлормеркурибензоата, ЭДТА, о-фенантролина, 10-3 М ) также не пре-вышал 25% либо вообще не проявлялся (например, при использовании в качестве субстрата сывороточного альбумина). Более детальные исследования влияния фенилметилсульфонил-фторида, р-хлормеркурибензоата и набора комплексонов на расщепление фибриногена про-теиназами дифтерийного токсина показали, что в водно-солевом растворе использованные соединения оказали слабое воздействие (± 10-15%) на фибриногенолитическую активность. Лишь в присутствии ионов Hg2+ эта активность снижалась на 65%. Дестабилизация структу-ры токсина 4М мочевиной вела к слабому угнетению протеолиза фенилметилсульфонилфто-ридом и о-фенантролином (на 20% и 22% соответственно). При этом подавление протеоли-тической активности ионами Hg2+ было полным. Дестабилизация структуры белка 80% ди-метилсульфоксидом вела к заметному усилению ингибирующего влияния фенилметилсуль-фонилфторида (- 60%), ЭДТА (- 48%), K4FeCN6 (- 40%), а также проявлению модицифици-рующего влияния диэтилдитиокарбамата: протеолитическая активность возрастала на 36%. Во всех случаях фибриногенолитическая активность мало изменялась в присутствии р-хлормеркурибензоата, азида или цианида. Как показали сравнительные исследования, эти особенности резко отличают протеиназные свойства дифтерийного токсина штамма PW-8 от таковых внутриклеточных и внеклеточных протеиназ в условиях благоприятных для токси-ногенеза. Так, протеиназы этого штамма во всех случаях сильно угнетались р-хлормеркурибензоатом, о-фенантролином, но не фенилметилсульфонилфторидом. Более то-го, они дают основания считать, что протеолитические сайты токсина в водно-солевом рас-творе при рН 7,4 мало доступны ряду эффекторов. Эти сайты, по-видимому содержат метал-лы переменной валентности и остатки цистеина. Можно также думать, что в дифтерийном токсине имеется не один протеолитический сайт, чем вызвано неоднозначное действие ком-плексонов на молекулу этого белка при ее дестабилизации.


Область применения: физиология и биохимия патогенных микроорганизмов, энзимология, экспериментальная медицина, медицинская биотехнология
Рекомендации по использованию: полученные факты следует учитывать в биотехнологии вакцинно-сывороточных препаратов
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования с институтами и центрами, разрабатывающими вопросы медицинской биотехнологии, биохимии и физиологии патогенных микроорганизмов, а также структуры и функции белков токсинов и протеиназ в Беларуси, странах СНГ и дальнего зарубежья


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта