Цель работы – оптимизация полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для одновременной детекции возбудителей хламидиально-микоплазменной природы в мокроте пациентов с двухсторонней интерстициальной пневмонией.

В ходе работы были синтезированы видоспецифичные праймеры: праймеры для детекции Сhlamydophila pneumoniae Chl.pn.1 - 5^| CATGGTGTCATTCGCCAAGT 3^|, Chl.pn.2 - 5^| CGTGTCGTCCAGCCATTTTA 3^|; олигонуклеотидная меченая проба 5^| FAM TCTACGTTGCCTCTAAGAGAAAACTTCAAGTTGGA TAMRA 3^|; праймеры для детекции Mycoplasma pneumoniae М.pn.1 - 5^| CCAACCAAACAACAACGTTCA 3^|; М.pn.2 - 5^| ACCTTGACTGGAGGCCGTTA 3^|, олигонуклеотидная меченая проба 5^| FAM TCAATCCGAATAACGGTGACTTCTTACCACTG TAMRA 3^|.

Исходные значения температурных режимов амплификации были определены экспериментально:

1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали)
+95⁰С…5 мин.

2. Отжиг (присоединение праймеров)
+50⁰С…2 мин.
+95⁰С…10 мин.

3. Элонгация (достраивание цепей ДНК)
+95⁰С…15 сек. – 50 циклов
+60⁰С…1 мин.

Оптимизированная мультиплексная количественная реал-тайм ПЦР для одновременной детекции Mycoplasma pneumoniae и Сhlamydophila pneumoniae в мокроте детей и подростков с двусторонней интерстициальной пневмонией является лучшей альтернативой традиционной ПЦР в целях клинической диагностики, т.к. результаты доступны в течение 4-5 часов в высоко стандартизированном формате без обработки ПЦР продуктов, что снижает риск ложноположительных результатов, которые могут иметь место при манипуляциях с ампликонами. Данная методика дает возможности детектировать несколько патогенов одновременно, что чрезвычайно экономично для образцов малого количества. Другое преимущество технологии состоит в возможности количественного учета амплифицированного продукта, что дает возможность выявлять различия в инфекционной нагрузке между асимптоматичными носителями.

По результатам исследования подана заявка на патент: Способ определения концентрации ДНК Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в биологическом материале.