Целью данного проекта является разработка нового метода определения степени амплификации c-erbB-2 с помощью количественного определения РНК онкогена методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в формате реального времени. Это позволяет разработать высокочувствительные и клинически доступные молекулярные технологии определения гиперэкспрессии онкогена с-erbB-2 и проводить относительную количественную оценку уровня экспрессии онкогена. При создании набора использованы новейшие достижения биотехнологии и молекулярной биологии, включая выделение из опухолевой ткани и транскрипцию РНК, молекулярное клонирование ДНК гликопротеина her-2 – продукта экспрессии онкогена c-erbB-2 (в качестве положительного контроля), относительную количественную ПЦР.

В результате проведенной работы разработан и оптимизирован метод выделения тотальной РНК из образцов опухолевой ткани больных раком молочной железы (РМЖ) с использованием неорганического сорбента, позволяющий получать высокоочищенную РНК.

Для амплификации и детекции кДНК онкогена c-erbB-2 и гена глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (внутреннего контроля) сконструированы и синтезированы праймеры и комплементарные зонды для гибридизации, содержащие флуоресцентные красители. Для оптимизации условий полимеразной цепной реакции в формате реального времени применялись различные концентрации плазмиды, содержащей фрагмент кДНК.

Проведение ПЦР и обработку полученных данных проводили с использованием RotorGene 3000. За относительный уровень экспрессии онкогена с-erbB-2 принимали соотношение концентраций кДНК с-erbB-2 и кДНК глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPD). Оценка уровня экспрессии онкогена с-erbB-2 с использованием относительной количественной ОТ-ПЦР проведена в 121 образце. Гиперэкспрессия онкогена с-erbB-2 присутствовала в 28 (23,1%) образцах опухолевой ткани. В 93 (76,9%) образцах экспрессия либо отсутствовала, либо была минимальной.

На клиническом материале проведен сравнительный анализ определения уровня экспрессии онкогена c-erbB-2 с помощью ПЦР-диагностики и референтного метода – иммуногистохимии (ИГХ) с парафиновых блоков опухолей 81 больной раком молочной железы из той же группы обследуемых. В 15 случаях выявлена гиперэкспрессия онкогена и онкопротеина с-erbB-2 по результатам ОТ-ПЦР и ИГХ, в 52 случаях – низкая экспрессия. В 7 случаях при наличии гиперэкспрессии онкопротеина с-erbB-2 по данным ИГХ (++) отсутствовала гиперэкспрессия мРНК онкогена.

Полученные данные свидетельствуют о высокой степени корреляции двух методов и необходимости проведения дополнительного исследования при полном окрашивании мембраны более 10% клеток средней интенсивности (++) по результатам ИГХ-исследования с использованием ОТ-ПЦР.