Клетки лимфобластоидной линии IM-9 (American Type Culture Collection CCL-199) культивировались в среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мкМ L-глютамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа при периодической замене питательной среды (каждые 3-4 дня) и ежедневном рентгеновском облучении на аппарате РУМ-17 в дозе 0,75 Гр в течение 5 дней (один цикл). Циклы облучения (12), проводились каждые 2 недели. Общая доза облучения 45 Гр. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью МТТ-теста, который характеризует дегидрогеназную активность митохондрий, рассчитывалась доза, вызывающая 50%-ную гибель клеток (ЛД50). Установленная сублиния, названная IM-9/RR, обладает в 2,5 раза большей резистентностью к индуцирующему агенту, чем клетки родительской линии IM-9 (см. рис.).

Используя методы выделения тотальной клеточной РНК, ДНК, синтеза кДНК, коамплификации некоторых генов с применением соответствующих праймеров, другие молекулярно-биологические методы, методы проточной цитометрии с применением моноклональных антител к специфическим белкам, флуоресцентных красителей, исследована экспрессия некоторых генов, функциональная активность транспортных белков, принимающих участие в регуляции ряда фундаментальных внутриклеточных процессов, в том числе, возможно и в формировании устойчивости к ионизирующему излучению. Между линией IM-9 и сублинией IM-9/RR не выявлено различий в экспрессии кодирующего образование белка P-gp гена MDR1, ответственного за лекарственную устойчивость; в количестве этого белка; а также другого белка множественной лекарственной резистентности MRP; в экспрессии гена hPMS2 (участвует в системе репарации путем замены модифицированных участков); гена р53 (интегратор внутриклеточных сигналов повреждения, запускающих апоптоз или репарацию ДНК) или в наличии его мутаций в экзонах 5-8; в амплификации гена MDM2 (играет роль в стабильности р53) и мутаций в его ДНК-связывающем участке.

С помощью теста удержания в клетках флуоресцентного красителя родамина 123 установлено, что функциональная активность P-gp в клетках полученной сублинии умеренно повысилась и подавляется специфическим ингибитором этого белка циклоспорином А. Аналогичные данные получены при использовании красителя JC1. Функциональная активность другого участвующего в формировании устойчивости клеток белка LRP, оцениваемая с помощью специфического зонда кальцеина и его блокатора пробенецида, также не резко изменилась в сублинии IM-9/RR. В то же время активность белка BCRP, оцениваемая с помощью специфического зонда митоксантрона, была практически идентичной в исходной линии и полученной сублинии.

Результаты цитогенетического анализа свидетельствуют, если клетки родительской линии имеют диплоидный кариотип с наличием инверсии хромосомы 3 (p24;q28), деривата хромосомы 12 и транслокаций t(3;6)(p21;q35) и t(1;12)(q24;q23), то в клетках IM-9/RR присутствуют новые структурные и числовые хромосомные аберрации, в частности +5, +17, делеции хромосом Х и 7, транслокация t(1;7)(p31;p22), которые имели клональный характер.

В нашей экспериментальной системе становление радиорезистентности не совпадает с параллельным развитием перекрестной химиорезистентности, так как клетки сублинии IM-9/RR, напротив, приобретают большую чувствительность к таким цитостическим препаратам, как винкристин, этопозид, цисплатин, аналоги пуриновых нуклеозидов, что является перспективным в терапевтическом плане. В меньшей степени это касается доксорубицина и иринотекана.

Клеточная сублиния IM-9/RR поддерживается в культуре, имеет стабильные свойства и хранится при температуре жидкого азота.