В настоящее время идентифицированы 4 генотипа вируса гепатита А (ВГА), выделенные от больных и контактных в разных регионах мира. Это I, II, III, VII генотипы, имеющие идентичный антиген и принадлежащие к одному серотипу. Различия выделенных изолятов ВГА можно установить на молекулярном уровне, определяя первичную структуру генома.

Геном вируса гепатита А, единственного представителя рода Hepatovirus семейства Picornaviridae представлен однонитевой РНК, выполняющей функцию матричной с положительной полярностью. В литературе, начиная с 1992 описано 7 генных подтипов ВГА, среди 152 выделенных изолятов в разных регионах мира. По результатам сиквенса этих подтипов генотипы I и III подразделены еще на два субгенотипа IB и IА, отличающиеся при секвенировании не более, чем на 7– 5 % пар оснований.

Выделены штаммы МI –1 и МБ-7, циркулирующие на территории России в городах Москве и Новосибирске (1,4). В настоящее время установлены генотипы прототипных штаммов НМ-175, НАS -15, отнесенные соответственно к типам IB и IА. Штаммы циркулирующие на территории Беларуси неизвестны, т.к не проводились. подобного рода исследования.

Цель настоящего проекта – определение генотипов вируса гепатита А в Беларуси и установление вариабельности генома.

Для выполнения поставленной темы были сформулированы и выполнены следующие основные работы: собран клинический материал от больных и контактных; проведено выделение из него вируса в культуре клеток; выделена РНК и амплификацирована кДНК из культуральных изолятов; проведена рестрикция фрагментов кДНК и анализированы длины рестрикционных фрагментов для сравнения с прототипным штаммом.

В культуральных изолятах ВГА определен уровень антигена в ИФА. Специфичность подтверждена в конфиматорном тесте иконкурентном ИФА. Уровень антигена находится в пределах ОП.535 -0,969. Амплифицированы по два фрагмента генома в области 3Д размерами 276 и 479 пар оснований из трех изолятов, выделенных от контактных и больных ГА (№№ 4, 7 и 18/3).

Проведена рестрикция генома ВГА эндонуклеазами. Сравнительный анализ Alu1 рестрикционных профилей короткого фрагмента всех изолятов показал, что все профили как в изолятах, выделенных в Беларуси, так и в прототипном штамме отличались от профиля рестрикции референс штамма.

При сравнении Hinf I - профилей рестрикции кДНК фрагмента 489 п.о. с аналогичным профилем рестрикции референс-штамма HM-175 было выявлено в двух изолятах №№ 4 и 7 присутствие более высокомолекулярных фрагментов ДНК, а в изоляте 18/3 в отличии от проб №№4 и 7 зарегистрировано отсутствие одного сайта узнавания, что свидетельствует о наличии мутаций в анализируемой области неструктурного белка (рис. 1).

1 - фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 7, обработанный эндонуклеазой Hinf I 2 - фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 18/3, обработанный эндонуклеазой Hinf I 3 - фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 4, обработанный эндонуклеазой Hinf I 4 - ДНК маркер GeneRuler 100bp DNA ladder; 5 - фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 7, обработанный эндонуклеазой Alu I 6 - фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 18/3 , обработанный эндонуклеазой Alu I 7 – фрагмент кДНК 489 п.о. пробы № 4 , обработанный эндонуклеазой Alu I

8 – фрагмент кДНК 489 п.о. необработанный ферментами рестрикции.

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов рестрикции фрагмента 489 п.о. в 20%

Других изменений в сайтах узнавания изученного региона 3D1 не выявлено и можно классифицировать изоляты ВГА, циркулирующие на территории Беларуси, как модифицированные штаммы, родственные штамму HM-175 и относящиеся к типу 1В.