В настоящее время применение стволовых клеток человека (СК) для лечения заболеваний различной этиологии рассматривается как перспективный метод, альтернативный химиотерапии и хирургическому лечению.

Уже в настоящее время гемопоэтические СК (ГСК) применяются для лечения больных с лимфопролиферативными заболеваниями (множественная миелома, неходжкинская лимфома, болезнь Ходжкина), включаются в протоколы лечения болезни Паркинсона, Альцгеймера, диабета первого типа, инфаркта миокарда, апластической анемии. Создаются экспериментальные подходы к лечению рака почки, молочной железы, остеопороза, системной красной волчанки, поражений суставов, переломов костей.

Цель работы – подготовка методологической основы клинического применения заместительной клеточной терапии: разработка стандартизованных протоколов культивирования и направленной дифференцировки стволовых клеток в желаемые типы клеток in vitro с использованием химически однородных культуральных сред с контролируемым содержанием рекомбинантных цитокинов и ростовых факторов.

Сущность достижения – определение условий длительного культивирования и методологии направленной дифференцировки стволовых клеток в миелоидные клетки, остеобласты, хондроциты, адипоциты на основе использования цитокинов и регуляторов роста.

В результате проведенных исследований отработана технология выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга, пуповинной крови, лейкоконцентрата периферической крови человека, полученного после мобилизации стволовых клеток путем введения рекомбинантного гранулоцит-колониестимулирующего фактора, методом адгезии на пластике. Определены оптимальные условия культивирования in vitro стволовых мезенхимальных и гемопоэтических клеток.

Изучены особенности роста и морфологические характеристики МСК первичной культуры и последующих пассажей. Отработана методика наращивания аллогенных МСК in vitro из минимального количества костного мозга. Изучена дифференцировка МСК костного мозга в клетки стромы по их функции в поддержке гемопоэза и при совместном культивировании гемопоэтических стволовых клеток и МСК. Исследовано влияние МСК на пролиферативную активность клеток-предшественниц гемопоэза.

Показано, что гемопоэтические клетки-предшественницы при совместном культивировании с МСК пролиферируют in vitro только в присутствии ростовых факторов. Мезенхимальные клетки поддерживают пролиферацию более ранних предшественников гемопоэза в отличие от ростовых факторов (IL-3, IL-6, SCF, Flt-3L), которые поддерживают пролиферацию и дифференцировку коммитированных предшественниц кроветворения. При экспансии гемопоэтических стволовых клеток в питательной среде без трансферина, эритропоэтина и других цитокинов, стимулирующих эритропоэз, МСК не поддерживают пролиферацию и дифференцировку эритроидных предшественников.

Дана иммунофенотипическая характеристика МСК, выделенных из костного мозга и пуповинной крови по присутствию маркеров CD105 (SH2), CD90, CD140 (PDGFα) и отсутствию маркеров СD45 и CD34. Установлено, что после экспансии ГСК периферической крови происходит снижение количества Т- и В-клеток, СD34+ клеток, а также клеток эритроцитарного ряда, возрастает количество клеток моноцитарного и гранулоцитарного ряда по сравнению с неэкспансированными клетками. Не выявлено статистически достоверных различий субпопуляционного состава клеток, полученных после совместного культивирования ГСК периферической крови с мезенхимальными клетками и без них.

Образцы пуповинной крови резко различаются по содержанию ранних и коммитированных клеток-предшественников. МСК ПК обладают ограниченной пролиферативной активностью, требуют дополнительных факторов роста и повышенного содержания АВ (IV) сыворотки. Показано, что пролиферативная активность в первичной культуре МСК жировой ткани выше, чем в первичной культуре МСК костного мозга.

Отработаны методики дифференцировки МСК костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях.