С целью оценки перспектив применения рекомбинантного иммунотоксина на основе фрагмента с-ErbB2-специфичного моноклонального антитела 4D5 и бактериальной РНКазы (барназы) как нового средства терапии рака получен и исследован химерный белок scFv4D5-барназа. Онкомаркер с-ErbB2 (иные обозначения: Her2/neu, p185Her2) является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста; лиганд данного рецептора не установлен. Гиперэкспрессия с-ErbB2 на мембране трансформированных клеток наблюдается при раке молочной железы, карциноме яичников, легких и других опухолях и сопровождается снижением числа рецепторов эстрогенов, что приводит к снижению эффекта химиотерапии и неблагоприятному прогнозу. Терапия в этом случае требует новых подходов, одним из которых является использование рекомбинантных иммунотоксинов, содержащих узнающий онкомаркер фрагмент молекулы антитела и цитотоксический белок или его фрагмент. Исследованный в данной работе иммунотоксин scFv4D5-барназа содержит антигенсвязывающий scFv фрагмент, представляющий собой укороченный до двух варибельных доменов (VL и VH) аналог гуманизированного моноклонального антитела 4D5 (герцептина, международное название «Трастузумаб»), направленного к онкомаркеру с-ErbB2 и применяемого для комбинированной терапии химиорезистентных опухолей молочной железы и яичника.

Цитотоксическим фрагментом иммунотоксина является барназа – РНКаза из бактерии Bacillus amyloliquefaciens. Плазмида с геном, кодирующим структуру белка, сконструирована в ходе совместных работ с лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва (зав. лабораторией проф. С.М. Деев).

Сущность достижения и его новизна заключаются в получении нового рекомбинантного белка как потенциального иммунотоксина для терапии рака, а также данных о его конформации и установлению способности к связыванию и элиминации клеток рака молочной железы. Разработан протокол экспрессии химерного белка в клетках E.coli. Разработан метод отделения специфического ингибитора барназы – барстара, экспрессированного в комплексе с иммунотоксином с целью устранения цитотоксичности для клетки-хозяина, и протокол очистки целевого белка с использованием металл-хелатной хрома тографии и хроматографии на белок А-сефарозе. Совокупность методов обеспечивает получение рекомбинантного иммунотоксина с чистотой около 99 %.

Первичным условием для оценки химерного белка как потенциального терапевтического агента является формирование компактной конформации и потенциала структурных взаимодействий, обеспечивающих достаточную стабильность белка в условиях его применения с сохранением функциональных свойств. Методами флуоресцентной и КД спектроскопии в сочетании с дифференциальной сканирующей калориметрией показаны упорядоченность вторичной и компактность третичной структур химерного белка, свойственные исходным структурным блокам (модулям) иммунотоксина в их нативной конформации. Тепловые переходы антигенсвязывающего и РНКазного модулей при физиологических рН разделены в шкале температур (52 и 65оС соответственно), а характер их изменения свидетельствует о структурной независимости двух гетерологичных модулей. Энтальпия переходов (Δh=8,6 кал/г для барназы и 3,9 кал/г для scFv фрагмента при рН 7,4) подтверждает достаточную стабильность химерной конструкции в целом. Показано сохранение в иммунотоксине РНКазной активности как условия его потенциальной цитотоксичности для клеток-мишеней.

Разработаны варианты количественного определения иммунотоксина иммуноферментным анализом в субмикрограммовом диапазоне на основе антител к барназе и иммуноглобулинам мыши и человека. Показано связывание химерного белка с линиями клеток рака молочной железы (BT-474, HS-578T, MCF-7, MDA-MB-231) с различным уровнем экспрессии с-ErbB2. Для высокоэкспрессирующей линии BT-474 константа связывания иммунотоксина имеет тот же порядок величин (Ка ~ 10-8 М), что и для «родительского» полноразмерного антитела 4D5. Предварительные исследования показали, что инкубация иммунотоксина scFv4D5-барназа in vitro с клетками BT-474 в течение 5 суток приводит к выраженному цитотоксическому эффекту с гибелью до 60 % клеток по данным тестов с МТТ, резазурином, трипановым синим и нейтральным красным. Совокупность функциональных и структурных данных свидетельствует о способности иммунотоксина scFv4D5-барназа эффективно элиминировать клетки рака молочной железы и о перспективности его дальнейшего исследования как потенциального нового агента для иммунотерапии рака.