Исследованиями последних лет установлено, что возникновение и прогрессию неопластических заболеваний определяют не только классические генетические изменения, но и изменения, связанные с метилированием ДНК. Так, при острых лейкозах, хроническом миелоидном лейкозе, миелодиспластическом синдроме на фоне общего гипометилирования генома обнаруживается гиперметилирование отдельных генов. Такое гиперметилирование регуляторно-промоторных областей характерно для генов-супрессоров опухолей и генов клеточного цикла (house-keeping genes) при ряде лейкемий. В процессе лечения гематологических неоплазий постепенно происходит селекция лейкемических клеток, резистентных к противоопухолевым препаратам. Доминирующим фактором развития такой устойчивости является повышенная транскрипционная активность гена множественной лекарственной устойчивости (multidrug resistance gene – MDR-1) гена, кодирующего мембранный белок – P-гликопротеин. Гипер- экспрессия данного гена ассоциируется также с неблагоприятным прогнозом при некоторых видах гемобластозов, например, при острых лейкемиях.

Наряду с этим наблюдается обратная корреляция между интенсивностью метилирования регуляторно-промоторной области гена (в т. ч. и гена MDR-1) и его транскрипционной активностью. В связи с этим была исследована взаимосвязь между характером метилирования 5’-промоторной области гена MDR-1 и клиническим статусом заболевания больных хроническим миелолейкозом.

В качестве исходного материала для выделения ДНК были использованы лейкоциты периферической крови и ядросодержащие клетки костного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в различных стадиях заболевания. Было исследовано 18 образцов ДНК больных ХМЛ.

В качестве контроля использовались образцы ДНК периферической крови 20 здоровых доноров. Во всех случаях диагноз подтверждался морфологическими, цитохимическими методами и методом иммунофенотипирования. В качестве материала для выделения ДНК использовались как цельные, так и фракционированные (с использованием фиколл-верографинового градиента с плотностью 1.077) препараты крови и костного мозга. Около 500 нанограмм ДНК инкубировали с 25 ЕД рестрикционной эндонуклеазы HpaII (чувствительной к метилированию ДНК) или MspI (нечувствительной к метилированию ДНК) в течение 16-18 ч при 37oC. Полученные образцы использовали в ПЦР.

Синтезированы праймеры к МD1, МD2 и MDC-фрагментам 5’-промоторной области MDR-1 гена с целью выполнения метилчувствительной полимеразных цепей реакции (МЧ-ПЦР). Это 5’-праймеры к MD1-области: MD1/5 5’- TCT AgA gAg gTg CAA Cgg AAg-3’; MD1/3 5’-TCA gCC TCA CCA CAg ATg AC-3’ (120 пар нуклеотидов, пн; и к MD2-области 5’-промоторной области MDR-1 гена: MD2/5 5’-TgA AgT CCT CTg gCA AgT CC-3; MD2/3 5’-ATT CTC CCT CCC ggT TCC-3’ (210 пн). В качестве контроля синтезированы праймеры к участку промоторной области MDR-1 гена, не содержащей CpG-последовательностей и, следовательно, не подверженной гидролизу HpaII/MspI рестрикционными эндонуклеазами: MDC5 5’-ATT TCA CgT CTT ggT ggC C-3’ и MDC3 5’-TCC AgT gCC ACT ACg gTT Tg-3’ (240 пн).

Для анализа состояния метилирования 5’-промоторной области MDR-1 гена в реакцию (общий объем реакции – 5 мкл) использовали каждый праймер в концентрации 1 мкмоль/л. МЧ-ПЦР выполняли в течение 30 циклов: 1-й цикл: 95°С – 3 мин, 57°С – 1 мин и 72°С – 2 мин. Циклы 2-30: 95°С – 30 с, 60°С – 30 с, 72°С – 10 мин. 8-10 мкл реакционной смеси вносили в лунку с 2% агарозным гелем. Затем гель окрашивали этидиум-бромидом, фотографировали и сканировали в гель-документирующем устройстве.

Ранее было установлено, что интенсивность метилирования гена кальцитонина прямо коррелирует с прогрессией многих онкогематологических заболеваний. В связи с этим параллельно была выполнена МЧ-ПЦР с праймерами КТ1 5’-CAT CTg TAC CTT gCA ACT CA-3’ и КТ5 5’-TgC AgT gCg AgA gAg TAA gA-3’ к М4 сайту 5’-области гена кальцитонина человека (ГК) с образцами ДНК периферической крови больных ХМЛ, находящихся в различных стадиях заболевания (после рестриктазной обработки образцов ферментом HpaII, см. выше). В результате МЧ-ПЦР амплифицировали фрагмент размером 1196 пн. Количество продукта ПЦР находилось в прямопропорциональной зависимости от стадии болезни. Нашими исследованиями показано, что в большинстве случаев ХМЛ существует обратная корреляция между уровнем метилирования MDR-1-гена и степенью прогрессии заболевания. Оптическая плотность продуктов MЧ-ПЦР с MD1 и MD2-парами праймеров (фрагменты ДНК размером 120 и (или) 210 пн), полученная при сканировании геля после ПЦР, была максимальной у здоровых доноров и достоверно понижалась в образцах ДНК больных ХМЛ по мере прогрессии болезни. Это свидетельствует о метилировании 5’-CCGG-последовательностей внутри сайтов MD1 и MD2 у здоровых доноров и снижении уровня метилирования 5’-промоторной области в ДНК пациентов. Такие результаты были получены со всеми образцами ДНК периферической крови здоровых доноров. Также выполнена МЧ-ПЦР с контрольной парой праймеров к 5’-промоторной области гена MDR-1, не содержащей CCGG-сайтов (MDC).

Во всех случаях нормы и патологии амплифицировался контрольный фрагмент 5’-промоторной области гена MDR-1 размером 240 пн, оптическая плотность которого менялась незначительно во всех исследованных образцах ДНК. При ПЦР-анализе образцов ДНК, подвергшихся гидролизу MspI, также амплифицировался только контрольный фрагмент, т. к. «рабочие» фрагменты ДНК, содержащие CCGG-сайты (по которым и метилируется цитозин у человека), подверглись полному гидролизу. В то же время оптическая плотность продукта ПЦР гена кальцитонина при прогрессии ХМЛ прогрессивно возрастала. Путем сравнения средней оптической плотности амплифицированных фрагментов MD1 и MD2 с фрагментом ГК (праймеры КТ1/КТ5) было установлено повышение соотношения ГК/MDR-1 по мере прогрессии ХМЛ. Так, соотношение оптической плотности ГК/MDR-1 менялось от 1,0 у здоровых доноров до 1,5 при ХМЛ в хронической фазе; 2,2 в фазе акселерации и 3,0 и более при бластном кризе. Поскольку деметилирование 5’-промоторной области гена MDR-1, как правило, коррелирует с экспрессией самого гена, можно предположить наличие селекции лейкозных клеток с фенотипом множественной лекарственной устойчивости в процессе лечения ХМЛ. Полученное соотношение оптической плотности можно использовать как метод косвенной оценки эффективности проводимой терапии, а также для определения оптимальных сроков пересадки костного мозга у больных ХМЛ. Так, например, рост данного индекса до 2 единиц и более, скорее всего, косвенно свидетельствует о неэффективности терапии и прогрессивном развитии устойчивости к применяемым препаратам. В такой ситуации аллогенная трансплантация костного мозга или трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является терапией выбора.

В данном исследовании проанализированы возможности применения метилчувствительной ПЦР для выявления патологического метилирования отдельных генов на примере метилирования 5’-промоторной области гена MDR-1 в норме и при лейкозах. Как показано, ген MDR-1 имеет прямое отношение к ответу на химиотерапию онкогематологического заболевания, а деметилирование ДНК в его регуляторно-промоторной области, как правило, коррелирующее с экспрессией гена, может служить ранним маркером селекции опухолевого клона, резистентности к терапии и опухолевой прогрессии. Дальнейшие исследования должны выявить связь между характером метилирования 5’-промоторной области гена MDR-1 и его транскрипционной активностью. Применение такого маркера в сочетании с другими генами-маркерами метилирования (ген кальцитонина и др.) позволит в перспективе создать специфическую панель метилирования для улучшения точности прогноза и рациональной модификации терапии онкогематологических заболеваний, а также возможно как вспомогательный метод для оценки контаминации трансплантата при ТГСК.