Несмотря на кажущуюся тривиальность вопроса влияние ионов неорганического ортофосфата на процессы протеолиза до сих пор недостаточно ясно. Данные литературы фрагментарны, систематических исследований о влиянии ортофосфата на реакции протеолиза не проводилось. Ранее нами показано, что неорганический ортофосфат способен увеличивать на 50-250% активаторную функцию стрептокиназы, урокиназы, и особенно, тканевого активатора плазминогена и в целом, в 1,2-12,0 раз лизис белков сериновыми протеиназами, папаином, металлопротеиназой Bacillus megaterium, а при <0,004 М и пепсином.

Методом лизиса желатина в тонком слое агарового геля (концентрация белка – 10 г/л, агара «Difco» – 10 г/л) с последующей визуализацией зон лизиса белков путем обработки пластин 1 н раствором трихлоруксусной кислоты изучено влияние различных солей ортофосфата в концентрации 0,00016-0,06 М на активность трипсина, α-химотрипсина, субтилизина, папаина, пепсина и металлопротеиназы Bacillus megaterium.

Использование в качестве растворителя дистиллированной воды, 0,05 М трис-HCl буфера рН 7,4 или 0,06 М фосфатного буфера рН 7,4 при расщеплении желатина протеиназами в диапазоне их концентрации от 1 до 0,0156 г/л показало, что ортофосфат в сравнении с дистиллированной водой или трис-HCl буфером усиливал протеолиз при низких концентрациях трипсина (0,25-0,0156 г/л) в 2-3 раза. Он способствовал потенцированию желатинолиза α-химотрипсином, особенно в сравнении с трис-HCl буфером: в фосфатном буфере при снижении концентрации этой протеиназы от 1,0 до 0,0156 г/л интенсивность расщепления белка падала на 40%, тогда как в трис-HCl буфере процесс полностью останавливался, а при использовании дистиллированной воды снижался на 50% уже при уменьшении концентрации химотрипсина до 0,125 г/л. Если в фосфатном буфере уменьшение концентрации субтилизина от 1,0 до 0,0156 г/л вело к уменьшению интенсивности желатинолиза на 45%, то в трис-HCl буфере или дистиллированной воде – на 60-70%. Фосфатный буфер предпочтительнее в качестве растворителя и при гидролизе белка папаином в минимальной концентрации: снижение интенсивности процесса при уменьшении концентрации протеиназы не превышало 30%, тогда как в трис-HCl буфере составляло 60%. Лишь в отношении металлопротеиназы бацилл именно трис-HCl (но не дистиллированная вода) оказался более предпочтительным растворителем: падение интенсивности гидролиза желатина при уменьшении концентрации энзима в этом растворителе и в фосфатном буфере составило 45 и 70% соответственно.

При низкой концентрации ортофосфата (0,0035 М) уменьшение концентрации пепсина от 1,0 до 0,5 и до 0,0156 г/л вело к снижению интенсивности расщепления желатина на 12 и 70% соответственно. В то же время в дистиллированной воде процесс угнетался на 55 и 90%.

Соли ортофосфорной кислоты разной степени замещения (NaH2PO4, Na2HPO4 и Na3PO4) также оказали неодинаковое воздействие на лизис желатина протеиназами. Наименее эффективен в потенцировании лизиса желатина трипсином Na2HPO4, тогда как Na3PO4 превосходит остальные соли во всем диапазоне концентраций (0,00016-0,01 М). Действие Na3PO4 и NaH2PO4 на расщепление же латина α-химотрипсином принципиально не различалось (±20% разницы), тогда как Na2HPO4 резко уступал этим солям в концентрации ≥ 0,00063 М. Если в концентрации 0,01 М Na3PO4 потенцировал протеолиз на 25%, то Na2HPO4 подавлял его на 60%. Более сложный характер зависимости наблюдался в экспериментах с остальными 4 протеиназами. Однако, в целом, для субтилизина предпочтительны добавки NaH2PO4, которые в диапазоне концентраций 0,00063-0,005 М сильнее потенцировали лизис желатина, чем остальные соли.

Расщепление желатина папаином подавлялось на 30-35% при добавках Na2HPO4 в концентрации ≥0,025 М или Na2HPO4 в концентрации 0,00032-0,00125 М, но не Na3PO4. Для желатинолиза, катализируемого пепсином или металлопротеиназой, предпочтительны добавки Na2HPO4, тогда как остальные соли в концентрации более 0,0025 М подавляли процесс полностью в случае пепсина или на 60-65% в случае металлопротеиназы.

Итак, присутствие в растворе ионов неорганического ортофосфата, в целом, активирует расщепление рядом протеиназ желатина. При низких концентрациях этих энзимов в ряде случаев в отсутствие ионов ортофосфата расщепление этого белка вообще не происходило. Неожиданными являются существенные различия в действии на активность протеиназ солей фосфата натрия различной степени замещения ортофосфорной кислоты. Следовательно, эффекты ортофосфата на протеолитические реакции зависят не только от природы протеиназы, расщепляемого белка субстрата, концентрации ортофосфата, но и от вида иона этого эффектора – его состава и свойств.

В мировой литературе этот вопрос не раскрыт. Между тем, учитывая, что основным белком тела человека и теплокровных животных является коллаген, а ряд патогенных микроорганизмов продуцирует протеиназы, лизирующие этот белок, полученные данные не только углубляют представления о молекулярных механизмах регуляции протеолиза, но и значимы для разработки подходов к созданию средств подавления патогенного действия протеиназ микроорганизмов.