УДК: 616.91/.93:578.7]:547.964.4
Год издания: 2008

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО ФРАГМЕНТЫ НУКЛЕОКАПСИДНОГО БЕЛКА ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Фомина Е.Г.Счесленок Е.П.Школина Т.В.Владыко А.С.
Рубрики: 76.03.41
Научно-исследовательский институт эпидемиoлогии и микробиологии
Тема НИР: разработать молекулярно-биологические способы диагностики особо опасных вирусных геморрагических лихорадок.
Сроки выполнения НИР: IV кв. 2006 г. - III кв. 2011 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук А.С. Владыко.
Источник финансирования: госбюджет.

Вирусные геморрагические лихорадки ста­новятся в последние годы все более серьезной проблемой в связи с возникновением вспышек тяжелых, нередко смертельных, заболеваний и с возможностью переноса инфекции из страны в страну и на другие континенты. В группу таких лихорадок входит Крымская-Конго геморраги­ческая лихорадка (ККГЛ) - вирусное природно-очаговое заболевание человека. Возбудитель от­носится к семейству Bunjaviridae, роду Nairovirus и передается преимущественно иксодовыми кле­щами. Геном представлен 3 фрагментами одноце­почечной РНК отрицательной полярности. Возбу­дитель относится ко 2-й группе патогенов, и рабо­ты с ним требуют соблюдения соответствующих мер безопасности.

Топологический анализ аминокислотной по­следовательности нуклеокапсидного белка вируса ККГЛ выявил 4 антигенные детерминанты, еди­нично представленные по всей поверхности бел­ка. Для создания рекомбинантного полипептида с достаточными антигенными свойствами исполь­зовался подход, который предполагает получе­ние мозаичных полипептидов, структура которых представляет собой многократно повторяющиеся антигенные детерминанты.

В экспрессирующий вектор клонированы фрагменты, кодирующие антигенные сайты ну­клеокапсидного белка вируса ККГЛ. Для этого были синтезированы четыре пары праймеров для реакции полимеризации, каждый из которых со­держал последовательность (92 нуклеотида), ко­дирующую по 3 повтора антигенного сайта (8 а.о. NNKDEMNK; N → C, 8-15 а.о.), и сайты для фер­ментов рестрикции. В качестве обратного прайме­ра выступала последовательность, состоящая из 15 нуклеотидов. Каждая последующая пара прай­меров отличается от предыдущей только сайтами рестрикции, необходимыми для клонирования в полилинкер (HindIII, EcoRI - первая пара прай­меров; EcoRI, XhoI - вторая пара; XhoI, PstI - третья пара; PstI, ApaI - четвертая пара). Прайме­ры были полимеризованы в реакции с фрагментом Кленова, обработаны ферментами рестрикции и клонированы последовательно в полилинкер экс­прессирующего вектора. Корректность вставки фрагмента в плазмиду контролировали с помо­щью рестрикционного анализа. Рекомбинантная плазмида трансформирована в пермиссивный штамм Escherichia coli - BL21(DE3) и индуциро­вана IPTG с целью экспрессии рекомбинантного полипептида.

В результате в культуре клеток, содержащих ре­комбинантные плазмиды, в отличие от контроль­ного лизата клеток выявляются зоны повышенной экспрессии белка в области, соответствующей теоретически рассчитанной молекулярной массе получаемых рекомбинантных полипептидов.

Таким образом, получены рекомбинантные по­липептиды, содержащие 6 и 12 повторов антиген-значимого участка нуклеокапсидного белка вируса ККГЛ. Эти полипептиды могут рассматриваться как потенциальные антигены, которые могут быть использованы для диагностики вируса.


Область применения: клиническая вирусология.
Рекомендации по использованию: данная разработка может быть использована для оценки эпидемиологической ситуации не только в Республике Беларусь, но и в странах ближнего и дальнего зарубежья.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования с научными лабораториями, занимающимися изучением и диагностикой ККГЛ, по оценке антигенной и иммуногенной активности полученных полипептидов.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта