УДК: 616.98:578.89]-085.28
Год издания: 2008

СТРУКТУРА ИНФЕКЦИОННОГО ПРИОННОГО БЕЛКА (PrPSc), ВЫЯВЛЯЕМАЯ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Капитулец С.П.Жавнерко Г.К.Парибок И.В.Полещук Н.Н.Капитулец Н.Н.Агабеков В.Е.
Рубрики: 76.29.5076.35.33
Научно-исследовательский институт эпидемиoлогии и микробиологии
Тема НИР: разработать диагностическую тест-систему для выявления прионной инфекции методом иммунного блоттинга
Сроки выполнения НИР: январь 2006 г. - декабрь 2009 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук Н.Н. Полещук.
Соисполнители: ГНУ «Институт химии новых материалов НАН Беларуси».
Источник финансирования: госбюджет.

Патологическая форма прионного белка - PrPSc (молекулярная масса 33-35 кДа) - является основным компонентом возбудителей, которые вы­зывают у человека болезнь Крейцфельдта-Якоба (БКЯ) и его новый вариант (вБКЯ), фатальную се­мейную бессонницу (ФСБ), синдром Герстманна-Штрейсслерра-Шейнкерра (СГШШ), амиотрофи­ческий лейкоспонгиоз (АЛ), у животных - скре­пи овец и коз, трансмиссивную энцефалопатию норок (ТЭН), хроническое истощение у оленей и лосей (ХИ), губкообразную энцефалопатию круп­ного рогатого скота (ГЭ КРС) и др. PrPSc отлича­ется от нормальной клеточной формы прионного белка - PrPC (М.м. 33-35 кДа), кодируемого гено­мом у всех млекопитающих, относительной про­теазоустойчивостью и трансмиссибильностью, т. е. способностью вызывать заболевание не толь­ко в другом организме того же вида-хозяина, но и у особей других видов. Конформационное об­разование PrPSc путем посттрансляционной моди­фикации PrPC является центральным событием в патогенезе прионных болезней. Третичная струк­тура PrPSc характеризуется высоким содержанием бета-структур, тогда как PrPC содержит преимуще­ственно альфа -спирали. Однако штаммоспецифиче­ские различия вторичной и третичной структур PrPSc и механизмы, лежащие в основе конверсии PrPC в PrPSc, окончательно не изучены.

Ферментативная обработка PrPSc в присутствии детергента удаляет N-концевую область белка с об­разованием компонента с приблизительной моле­кулярной массой 27-30 кДа (PrP27-30). PrP27-30 является высоко очищенной фракцией прионного белка, обладает протеазоустойчивостью и склон­ностью к полимеризации с образованием различ­ных по размеру прион-индуцированных структур, специфичных для каждой линии (штамма) PrPSc: глобул, палочек, скрепи-ассоциированных фила­ментов и др. Морфоструктурный анализ PrP27-30 может обеспечить дополнительной информацией об особенностях структуры штаммов прионов, хотя они имеют искусственное происхождение на этапе очистки.

Для получения информации о структуре PrPSc в виде изображений на твердой поверхности при исследовании образцов на воздухе при физиоло­гических условиях нами использована атомно-силовая микроскопия (АСМ). В основе метода лежит принцип механического сканирования с помощью микрозонда (тончайшая игла), который при перемещении вдоль поверхности образца очерчивает ее микрорельеф. На зеркальную пло­щадку, расположенную на выступающем конце микрозонда (над иглой), падает и от нее отражает­ся луч лазера. Отклонение луча при сканировании регистрируется фотодетектором, а полученные с его помощью данные используются в системе об­ратной связи, которая обеспечивает постоянную силу давления иглы на образец. Пьезоэлектриче­ский преобразователь регистрирует изменение ре­льефа образца в режиме реального времени.

В работе получены АСМ-изображения трех штаммов прионов: скрепи, шт. 263К, БКЯ, шт. БКЯ-ДВ и АЛ, шт. АЛ-Д. Штаммы накаплива­ли на лабораторных животных in vivo, выделяли, концентрировали и обрабатывали протеиназой К, как описано ранее (Полещук Н.Н. и др., 1993). Использовали подложки из кремния и пленки золота на кремнии (S~5 см2), которые готовили путем гидрофилизации при нагревании в смеси H2O:H2O2:NH4OH (в отношении 5:1:1) в течение 10-15 мин при температуре 67-72°С с последую­щим тщательным промыванием бидистиллирован­ной водой и высушиванием в токе азота. Допол­нительно пластинки с пленкой золота на кремнии были гидрофобизованы при выдерживании в рас­творе 1 мМ 16-меркаптогексадекана в спирте не менее 8 ч. На золотые и кремневые поверхности наносили по 50 мкл очищенных фракций PrP27-30 разных штаммов. Подложки обрабатывали в тече­ние 25 мин при комнатной температуре, тщатель­но промывали дистиллированной водой (20 раз по 50 мкл) и высушивали на воздухе (20 мин).

АСМ-изображения поверхности образцов полу­чали на воздухе с помощью микроскопа Nanoscope IIIa (Veeco, США), оборудованного «D-сканером», в контактном режиме (contact mode) или в режиме прерывистого контакта (tapping mode). Были ис­пользованы контактные 100- и 200-мкм кантиле­веры «Nanoprobe» из Si3N4 с константой упругости 0,12 и 0,36 N/m и тейпинговые иглы из кремния с резонансной частотой ~315кГц. Сила воздействия иглы на образец в контактном режиме составля­ла единицы нН. Частота строчной развертки при получении изображения варьировала от 1 до 5 Гц. Разрешающая способность метода составила при­мерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01нм по верти­кали. Смещая зонд по горизонтали, получали се­рию рельефов и с помощью компьютера получали трехмерное изображение PrPSc.

При микроскопии очищенных фракций гомоге­натов мозга, обработанных протеиназой К, методом АСМ выявлено наличие различных специфических структур, располагающихся на активированных поверхностях в виде характерных для прионных инфекций одиночных, реже довольно крупных ско­плений аномальных образований. Установлено, что патологические структуры прионов каждого штам­ма, выявляемые на поверхностях кремния и золота, по морфологии несколько различались.

Так, на локально-активированной подложке ги­дрофильного кремния, обработанного очищенной фракцией PrP27-30 скрепи, шт. 263К, выявляли 2 вида структур: глобулы с диаметром 5-10 нм и «трехлепестковые ассоциаты» с длиной лепестков от 200 до 270 нм (в среднем 250нм), причем пере­пад высот каждого из лепестков составляет от 8 до 40 нм.

На поверхности золотой подложки отмеча­ли множественные кристаллические структуры, представленные, как правило, несимметричными «четырехлучевыми звездами» с размером зерна, варьирующим от 0,1 до 9 мкм2. На лучах «звезд» просматриваются регулярные структуры с перио­дом ~12 нм. Максимальная длина кристаллитов достигает 9 мкм, а высота - до 140 нм. Между кристаллами наблюдались глобулярные структу­ры диаметром 8-10 нм и выше.

Результаты АСМ PrP27-30 штаммов БКЯ-ДВ и АЛ-Д коррелировали с данными, полученными на PrP27-30 скрепи, шт. 263К. Однако соотношения различных прион-индуцированных структур в об­разце и их размеры у этих штаммов прионов раз­личались.

Полученные данные позволяют по-новому оце­нить ключевые структуры PrP27-30, которые обе­спечивают специфичность исследованных штам­мов, определяемую существованием отличных друг от друга клинических синдромов и характер­ных только для них инкубационных периодов бо­лезни, различиями патоморфологической картины и специфическими патогенетическими поврежде­ниями в нервной ткани.

Вид патентной защиты: разработка охраноспособна.


Область применения: лабораторная диагностика прионных инфекций.
Рекомендации по использованию: штаммоспецифические различия структуры PrPSc у возбудителей прионных болезней.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по выделению, индикации, идентификации и верификации инфекционного патологического прионного белка в аутопсийном и биопсийном материале от человека и животных с клиническим диагнозом прионной инфекции (БКЯ, вБКЯ, АЛ, скрепи, ГЭ КРС и др.) для выявления различий биологических свойств штаммов возбудителей, причин разнообразия клинических синдромов и характерных только для них инкубационных периодов болезней, особенностей патоморфологических изменений, характера и накопления PrPSc в ЦНС.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта