Цель работы - выявить ранние лекарственно­индуцированные изменения количества апоптоти­ческих клеток в крови пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ) для установле­ния связи этих показателей с ответом на терапию.

Сущность достижения заключается в том, что на основе сравнения клинико-лабораторных пока­зателей на ранних этапах лечения ХЛЛ оценива­ется роль изменения содержания апоптотических клеток в прогнозировании терапевтического ответа. Новизна исследования состоит в том, что одно­временно анализируются результаты как химио-, так и иммунотерапии, причем данные определе­ния числа апоптотических лейкозных клеток по­лучены с помощью двух методов. Преимущества нашего подхода, связанные с возможностью сопо­ставления лабораторных и клинических данных, позволяют регистрировать клинический смысл раннего определения содержания апоптотических клеток в крови пациентов в процессе терапии.

Обследовано 32 пациента с В-клеточным ХЛЛ, которые получали стандартную химиотерапию или иммунотерапию моноклональными антитела­ми к CD52 (алемтузумаб). В первом случае среди пациентов выделяли подгруппы с частичной ре­миссией или без выраженного последующего от­вета на цитостатическую терапию при отсутствии прогрессирования болезни (стабилизация болез­ни) в соответствии с общепринятыми критериями, во втором- среди пациентов выделяли подгруп­пы с рецидивом заболевания в течение года или без рецидива в течение этого срока.

У пациентов до начала терапии и на 1-е, 2-е и 3-и сутки после назначения химиопрепаратов или моноклональных антител (алемтузумаб в течение первой недели вводили в возрастающих дозах по схеме 3, 10 и 30 мг соответственно в указанные дни) в образцах периферической крови, наряду с рекомендованными показателями, определяли содержание апоптотических лейкозных клеток. Апоптотические клетки идентифицировали на проточном цитофлуориметре по их способно­сти связывать специфические зонды Аннексин-V (Ann-V) или 3,3-дигексилоксакарбоцианин иодид (DiOC6), первый из которых выявляет трансло­кацию фосфатидилсерина на внешнюю сторону клеточной мембраны, характерную для запуска программы апоптоза, а второй - изменение мем­бранного потенциала, проникая как через цито­плазматическую, так и через митохондриальную мембраны и создавая отрицательный градиент мембранного потенциала между внешней средой и цитозолем, а также между цитозолем и мито­хондриями. Иммунофенотипирование клеток проводили с помощью панели моноклональных антител, которая позволяла идентифицировать лейкозные В-лимфоциты (CD19+/CD5+). Кроме того, в специальной серии опытов выделенные из крови пациентов клетки, на которых определяли уровень экспрессии CD20, подвергали in vitro в течение 3 ч действию моноклональных антител к этому антигену (лекарственный препарат мабтера) с последующей оценкой индукции апоптоза.

Таблица 1

 

Как видно из табл. 1, у пациентов, у которых в последующем наблюдался частичный ответ на химиотерапию, процент апоптотических клеток повысился в 2 раза на 1-е сутки, в 6,5 раз - на 2-е и в 3,5 раза - на 3-и сутки. Максимальное отно­сительное содержание апоптотических клеток до­стигало 18,2±7,8% (в диапазоне от 7,1 до 30,2%). При этом процентное содержание лимфоцитов, в том числе и В-лимфоцитов (CD19+), практически не изменялось. Вместе с тем нельзя не отметить, что общее количество лейкоцитов, а также лимфо­цитов и В-клеток в крови также заметно уменьши­лось (соответственно в 3,1; 4,0 и 3,7 раза) на 3-и сутки. Однако на 1-е сутки изменения этих пока­зателей были выражены незначительно, составляя 92, 82 и 81% от исходного уровня, тогда как от­носительное содержание апоптотических клеток уже составляло 219% от первоначального уровня. Четкие различия в величине изменения изучаемых показателей регистрировались и на 2-е сутки (бо­лее чем в 6 раз для апоптотических клеток и менее чем в 2 раза для сравниваемых показателей).

Из этой же табл. 1 следует, что при отсутствии выраженного последующего ответа на химиоте­рапию анализируемые общепринятые показате­ли обнаруживали лишь некоторую тенденцию к снижению на 3-и сутки, а процентное содержание апоптотических клеток в течение 3-х суток коле­балось в пределах 140, 195 и 123% от исходного уровня (максимально 3,52±0,97% на 2-е сутки), будучи тем не менее более чувствительным к воз­действию цитостатических препаратов, чем срав­ниваемые показатели.

В табл. 2 и 3 представлена динамика измене­ния содержания апоптотических клеток в крови пациентов с ХЛЛ, получавших в качестве терапии алемтузумаб.

Таблица 2

Группы пациентов	Количество AnnV+-клеток (%) в зависимости от введенной дозы препарата
	без препарата	3 мг	10 мг	30 мг
Рецидив в течение года	1,22 ± 0,59	2,42 ± 1,13	3,28 ± 1,89	4,18 ± 2,55*
Без рецидива в течение года	1,70 ± 0,50	12,10 ± 3,20*	9,60 ± 0,30*	13,35 ± 3,45*

Таблица 3

Группы пациентов	Средние значения мембранного потенциала (%) в зависимости от введенной дозы препарата
	без препарата	3 мг	10 мг	30 мг
Рецидив в течение года	100	93,15 ± 5,7	84,11 ± 10,20	74,81 ± 16,2
Без рецидива в течение года	100	83,50 ± 1,11*	64,50 ± 0,23*	29,30 ± 10,14*

Высокая чувствительность к терапии сопро­вождается достоверным нарастанием уровня свя­зывания В-лимфоцитами пациентов Ann-V в про­цессе лечения (количество апоптотических кле­ток максимально увеличивается в 7,8 раза после троекратного введения возрастающих доз алем­тузумаба через день) и приводит к достижению стабильного эффекта. Сдругой стороны, менее выраженное повышение (максимально в 3,4 раза) содержания апоптотических клеток в указанные ранние сроки исследования свидетельствует о бо­лее низкой чувствительности пациентов к терапии алемтузумабом.

Полученные результаты подтверждены при ис­следовании мембранного потенциала в клетках этих же пациентов. В табл. 3 показано достовер­ное снижение мембранного потенциала на фоне лечения алемтузумабом в группе пациентов, не имевших рецидива в течение последующего года, а также отсутствие такой динамики у пациентов с рецидивом в течение года после окончания те­рапии. Следовательно, снижение мембранного потенциала лейкозных клеток и повышение свя­зывания ими Ann-V являются маркерами индуци­рованного алемтузумабом апоптоза.

Учитывая, что проявление действия лекар­ственных препаратов, содержащих монокло­нальные антитела, связано с наличием соответ­ствующих антигенов на поверхности клеток, мы сопоставили содержание апоптотических клеток в образцах мононуклеарных клеток, подвергну­тых краткосрочному воздействию мабтеры (со­держит антитела к CD20) in vitro, с вариабельно­стью экспрессии этого антигена на клетках паци­ентов. Представленные на рисунке данные для трех типичных пациентов с В-ХЛЛ указывают на зависимость индукции апоптотического про­цесса в образцах клеток как от количества в них CD20-положительных клеток, так и от плотности рецепторов-мишеней на этих клетках.

Таким образом, раннее заметное повышение содержания апоптотических клеток в крови пациентов на фоне как иммуно-, так и химиотерапии свидетельствует о чувствительности организма к проводимой терапии и может использоваться в качестве одного из прогностических факторов.

Изменение уровня АnnV+ клеток в образцах крови, инкубированных с мабтерой in vitro, пациентов с ХЛЛ с различным уровнем экспрессии CD20