Новейший этап в развитии терапии онкологи­ческих заболеваний связан с методами биотерапии и, в частности, иммунотерапии с помощью реком­бинантных иммунотоксинов - химерных молекул на основе фрагментов антител и цитотоксических белков. Среди иммунотоксинов, конструируемых для терапии солидных опухолей, лидером про­движения в клинику являются химерные белки на основе scFv фрагмента терапевтического моно­клонального антитела 4D5 (герцептина, «Hercep-Hercep­tin»), направленного к онкогену-маркеру с-ErbB2. Гиперэкспрессия рецептора с-ErbB2 на мембране трансформированных клеток наблюдается при раке молочной железы, карциноме яичников, лег­ких и других опухолях и сопровождается сниже­нием эффективности химиотерапии и неблаго­приятным прогнозом. Включение герцептина в схемы комбинированной химиотерапии приводит к выраженному увеличению уровня терапевтиче­ского ответа, предположительно через механизм комплемент-зависимой цитотоксичности. Однако более высокие уровни противоопухолевой актив­ности могут быть достигнуты в случае примене­ния химерных иммунотоксинов прямого действия, не требующих участия комплемента и представля­ющих собой укороченные рекомбинантные анти­тела, конъюгированные с высокотоксичными для клетки белками растительного, бактериального или иного происхождения.

Объектом исследования является рекомбинант­ный иммунотоксин scFv4D5-барназа, созданный на основе scFv фрагмента герцептина (антитела 4D5) и РНКазы из бактерии Bacillus amyloliquefaciens.

Сущность достижения и его новизна заключа­ются в получении нового химерного белка - ре­комбинантного иммунотоксина scFv4D5-барназа, в установлении способности иммунотоксина к связыванию и элиминации клеток рака молоч­ной железы, а также в получении новых данных о механизме цитотоксического действия scFv4D5-барназы как потенциального агента для терапии онкологических заболеваний. Рекомбинантный иммунотоксин экспрессировали в клетках E.coli и хроматографически очищали до гомогенного состояния. Методами флуоресцентной и КД спек­троскопии, а также сканирующей калориметрии показаны корректность вторичной и компактность третичной структуры, структурная и функцио­нальная независимость узнающего и токсическо­го модулей иммунотоксина с сохранением обеих функций- антигенсвязывающей и РНКазной.

Оценка цитотоксической активности имму­нотоксина на опухолевых клетках с различными уровнями экспрессии онкогена с-ErbB2

Необходимым первым этапом доклинических испытаний потенциальных иммунотоксинов явля­ется анализ их цитотоксичности в культуре клеток опухоли.

По данным МТТ-теста, оценивающего оста­точную метаболическую активность митохондри­альных ферментов, инкубация рекомбинантного иммунотоксина scFv-барназа с клетками BT-474 в течение 5 суток приводит к выраженному цитоток­сическому эффекту, сопровождающемуся гибелью до 60% клеток. Цитотоксический эффект иммуно­токсина в отношении с-ErbB2-негативных клеточ­ных линий (MDA-MB-231 и MCF-7) был весьма ограниченным - выживаемость клеток в течение 5 суток составляла более 80% (рис. А), что свиде­тельствует о высокой избирательности действия исследуемой химерной конструкции в отношении клеток с гиперэкспрессией с-ErbB2. Специфич­ность действия иммунотоксина подтверждена в конкурентных экспериментах с использованием изолированного фрагмента scFv4D5, лишенного токсического модуля (барназы). Избыток добав­ленного scFv4D5 подавляет токсический эффект иммунотоксина и свидетельствует о том, что бло­када с-ErbB2 рецептора моновалентным scFv4D5 фрагментом сама по себе не приводит к гибели клеток-мишеней. Герцептин обладает собствен­ным цитотоксическим действием, которое зави­сит от присутствия сывороточного комплемента в среде культивирования и значительно снижается после прогрева фетальной сыворотки.

Исследование апоптотических процессов в опухолевых клетках, происходящих под действи­ем иммунотоксина

В настоящее время согласно данным литерату­ры нет единого мнения о вкладе процесса апоп­тоза в механизм цитотоксического действия им­мунотоксинов. Имеются свидетельства в пользу того, что связывание антиген-узнающего модуля иммунотоксина с рецептором с-ErbB2 приводит к активации апоптоза. Однако получены также дан­ные, в которых не обнаружены проявления апоп­тоза у клеток, подвергшихся действию с-ErbB2-специфичного иммунотерапевтического агента.

Мы оценивали уровень апоптоза в клетках раз­личных линий после их инкубации с иммунотоксином scFv4D5-барназа двумя методами. Первый из них- детекция так называемой «апоптотиче­ской лестницы» - основан на том, что апоптоти­ческая гибель клетки сопровождается активацией эндонуклеаз, атакующих преимущественно ин­тернуклеосомную ДНК. Врезультате высвобож­даются фрагменты ДНК, кратные размеру сегмен­тов ДНК, входящих в состав нуклеосомы (около 150 пар оснований), и регистрируемые методом электрофореза в агарозном геле. Наблюдаемая на геле (рис. Б) размытая дорожка («smear») для об­разца ДНК клеток линии BT-474 после инкубации с scFv4D5-барназой может означать начальную стадию апоптоза, инициированного иммуноток­сином (дорожки 5 и 6). Для ДНК клеток линии MCF-7 (дорожки 3 и 4) подобного явления не на­блюдается, что свидетельствует о слабо выражен­ных апоптотических процессах.

Схожие результаты были получены с использо­ванием набора реагентов DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System (Promega, США), который позво­ляет визуализировать фрагментированную вслед­ствие апоптоза ДНК путем присоединения к ее фрагментам биотинилированных нуклеотидов. Реакция катализируется ферментом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, визуализация продуктов реакции проводится детектирующим тандемом: стрептавидин-пероксидаза-диами-диами­нобензидин (рис. В). Результаты показывают, что иммунотоксин вызывает признаки апоптоза у кле­ток линии BT-474, в то время как у клеток линии MCF-7 апоптотическая фрагментация ДНК слабо выражена.

Таким образом, высокая специфичность связы­вания химерного белка scFv4D5-барназа с клетка­ми рака молочной железы in vitro, а также способ­ность к их эффективной элиминации свидетель­ствуют о перспективности дальнейшего изучения scFv4D5-барназы как нового потенциального агента для иммунотерапии рака.

Изучение биологической активности иммунотоксина scFv-барназа: А - Цитотоксическое действие scFv-барназы на клетки рака молочной железы различных линий; Б - детекция «апоптотической лестницы» методом электрофореза в агарозном геле. На гель наносили геномную ДНК, выделенную из инкубированных с иммунотоксином клеток MCF-7 (полосы 3, 4) и BT-474 (полосы 5, 6). Полосы 1, 2 - контроль клеток без иммунотоксина, 8 - стандарт молекулярных масс; В - апоптотическая фрагментация ДНК под действием иммунотоксина в клетках MCF-7 и BT-474. К - контроль (клетки BT-474, не подвергшиеся действию иммунотоксина) Метод детекции - DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System (Promega, США)