![]() |
УДК: 618.19-006.6-018:577.27]-097
Год издания: 2008
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИММУНОТОКСИН scFv4D5–БАРНАЗА, СПЕЦИФИЧНЫЙ К с-ErbB2-ПОЗИТИВНЫМ КЛЕТКАМ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИИ И ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Власов А.П., Середа В.В., Фима Д.В., Одинцов С.Г., Шубенок Д.В., Кравчук З.И., Деев С.М., Марцев С.П.
Рубрики: 76.29.33, 76.29.49
Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии
Тема НИР: получение химерного иммунотоксина на основе рекомбинантного белка, специфичного к онкогену с-ErbB2, и оценка его противоопухолевого действия in vitro.
Сроки выполнения НИР: I кв. 2006 г. - IV кв. 2008 г.
Научный руководитель: канд. хим. наук С.П. Марцев, д-р мед. наук, проф. М.П. Потапнев.
Источник финансирования: госбюджет.
Новейший этап в развитии терапии онкологических заболеваний связан с методами биотерапии и, в частности, иммунотерапии с помощью рекомбинантных иммунотоксинов - химерных молекул на основе фрагментов антител и цитотоксических белков. Среди иммунотоксинов, конструируемых для терапии солидных опухолей, лидером продвижения в клинику являются химерные белки на основе scFv фрагмента терапевтического моноклонального антитела 4D5 (герцептина, «Hercep-Herceptin»), направленного к онкогену-маркеру с-ErbB2. Гиперэкспрессия рецептора с-ErbB2 на мембране трансформированных клеток наблюдается при раке молочной железы, карциноме яичников, легких и других опухолях и сопровождается снижением эффективности химиотерапии и неблагоприятным прогнозом. Включение герцептина в схемы комбинированной химиотерапии приводит к выраженному увеличению уровня терапевтического ответа, предположительно через механизм комплемент-зависимой цитотоксичности. Однако более высокие уровни противоопухолевой активности могут быть достигнуты в случае применения химерных иммунотоксинов прямого действия, не требующих участия комплемента и представляющих собой укороченные рекомбинантные антитела, конъюгированные с высокотоксичными для клетки белками растительного, бактериального или иного происхождения.
Объектом исследования является рекомбинантный иммунотоксин scFv4D5-барназа, созданный на основе scFv фрагмента герцептина (антитела 4D5) и РНКазы из бактерии Bacillus amyloliquefaciens.
Сущность достижения и его новизна заключаются в получении нового химерного белка - рекомбинантного иммунотоксина scFv4D5-барназа, в установлении способности иммунотоксина к связыванию и элиминации клеток рака молочной железы, а также в получении новых данных о механизме цитотоксического действия scFv4D5-барназы как потенциального агента для терапии онкологических заболеваний. Рекомбинантный иммунотоксин экспрессировали в клетках E.coli и хроматографически очищали до гомогенного состояния. Методами флуоресцентной и КД спектроскопии, а также сканирующей калориметрии показаны корректность вторичной и компактность третичной структуры, структурная и функциональная независимость узнающего и токсического модулей иммунотоксина с сохранением обеих функций- антигенсвязывающей и РНКазной.
Оценка цитотоксической активности иммунотоксина на опухолевых клетках с различными уровнями экспрессии онкогена с-ErbB2
Необходимым первым этапом доклинических испытаний потенциальных иммунотоксинов является анализ их цитотоксичности в культуре клеток опухоли.
По данным МТТ-теста, оценивающего остаточную метаболическую активность митохондриальных ферментов, инкубация рекомбинантного иммунотоксина scFv-барназа с клетками BT-474 в течение 5 суток приводит к выраженному цитотоксическому эффекту, сопровождающемуся гибелью до 60% клеток. Цитотоксический эффект иммунотоксина в отношении с-ErbB2-негативных клеточных линий (MDA-MB-231 и MCF-7) был весьма ограниченным - выживаемость клеток в течение 5 суток составляла более 80% (рис. А), что свидетельствует о высокой избирательности действия исследуемой химерной конструкции в отношении клеток с гиперэкспрессией с-ErbB2. Специфичность действия иммунотоксина подтверждена в конкурентных экспериментах с использованием изолированного фрагмента scFv4D5, лишенного токсического модуля (барназы). Избыток добавленного scFv4D5 подавляет токсический эффект иммунотоксина и свидетельствует о том, что блокада с-ErbB2 рецептора моновалентным scFv4D5 фрагментом сама по себе не приводит к гибели клеток-мишеней. Герцептин обладает собственным цитотоксическим действием, которое зависит от присутствия сывороточного комплемента в среде культивирования и значительно снижается после прогрева фетальной сыворотки.
Исследование апоптотических процессов в опухолевых клетках, происходящих под действием иммунотоксина
В настоящее время согласно данным литературы нет единого мнения о вкладе процесса апоптоза в механизм цитотоксического действия иммунотоксинов. Имеются свидетельства в пользу того, что связывание антиген-узнающего модуля иммунотоксина с рецептором с-ErbB2 приводит к активации апоптоза. Однако получены также данные, в которых не обнаружены проявления апоптоза у клеток, подвергшихся действию с-ErbB2-специфичного иммунотерапевтического агента.
Мы оценивали уровень апоптоза в клетках различных линий после их инкубации с иммунотоксином scFv4D5-барназа двумя методами. Первый из них- детекция так называемой «апоптотической лестницы» - основан на том, что апоптотическая гибель клетки сопровождается активацией эндонуклеаз, атакующих преимущественно интернуклеосомную ДНК. Врезультате высвобождаются фрагменты ДНК, кратные размеру сегментов ДНК, входящих в состав нуклеосомы (около 150 пар оснований), и регистрируемые методом электрофореза в агарозном геле. Наблюдаемая на геле (рис. Б) размытая дорожка («smear») для образца ДНК клеток линии BT-474 после инкубации с scFv4D5-барназой может означать начальную стадию апоптоза, инициированного иммунотоксином (дорожки 5 и 6). Для ДНК клеток линии MCF-7 (дорожки 3 и 4) подобного явления не наблюдается, что свидетельствует о слабо выраженных апоптотических процессах.
Схожие результаты были получены с использованием набора реагентов DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System (Promega, США), который позволяет визуализировать фрагментированную вследствие апоптоза ДНК путем присоединения к ее фрагментам биотинилированных нуклеотидов. Реакция катализируется ферментом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, визуализация продуктов реакции проводится детектирующим тандемом: стрептавидин-пероксидаза-диами-диаминобензидин (рис. В). Результаты показывают, что иммунотоксин вызывает признаки апоптоза у клеток линии BT-474, в то время как у клеток линии MCF-7 апоптотическая фрагментация ДНК слабо выражена.
Таким образом, высокая специфичность связывания химерного белка scFv4D5-барназа с клетками рака молочной железы in vitro, а также способность к их эффективной элиминации свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения scFv4D5-барназы как нового потенциального агента для иммунотерапии рака.
Область применения: онкология, гематология, фармакология.
Рекомендации по использованию: в научных исследованиях по анализу терапевтических белков (природных и рекомбинантных) и взаимодействию с клетками-мишенями.
Предложения по сотрудничеству: проведение совместных работ по оценке рекомбинантных белков и цитотоксическому действию на клетки, оказание консультативной помощи по исследованию стабильности и конформации физиологически активных белков, в том числе терапевтического назначения.