Цель работы - оценить адекватность ис­пользования модифицированного цитотокси­ческого теста с 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ) для опреде­ления лекарственной резистентности лейкозных клеток к противоопухолевым препаратам.

Сущность достижения заключается в том, что использование менее трудоемкой и более эконо­мически оправданной методики определения ле­карственной чувствительности не менее эффек­тивно выявляет резистентность лейкозных клеток in vitro по сравнению со стандартной методикой.

Новизна предлагаемого подхода состоит в оцен­ке ответа клеток на терапевтические воздействия in vitro при использовании не ряда разведений препа­рата, а одной его дозы, которая близка к терапевти­ческой концентрации препарата в крови.

МТТ-тест основан на восстановлении бесцвет­ной соли тетразолия митохондриальными и цито­плазматическими дегидрогеназами живых метабо­лически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого изме­ряется спектрофотометрически. Для проведения МТТ-теста выделенные клетки в концентрации 2 × 10⁶/мл помещали в лунки 96-луночного план­шета в полной среде RPMI-1640 в присутствии лекарственных препаратов или без них. Культиви­ровали в стандартных условиях в течение 44 ч, по­сле чего вносили реактив МТТ на 4 ч и оценивали результаты.

В классическом варианте МТТ-теста определя­ли выживаемость клеток при различных дозах ци­тостатических препаратов (не менее 5 концентра­ций, крайние из которых различаются более чем в 100 раз). На основании средних значений жиз­неспособности из 3 параллельных измерений для каждой концентрации цитостатического препара­та вычисляли концентрацию IC50, при которой наблюдалось 50%-е подавление выживаемости лейкозных клеток. При предлагаемой постановке теста использовали только одну концентрацию хи­миопрепарата (С_тер), соответствующую терапевти­ческой концентрации в крови пациента а процессе лечения. В последнем случае вычисляли среднюю выживаемость клеток при С_тер.

Образцы клеток классифицировали по чув­ствительности относительно медианного значе­ния IC50 и по выживаемости клеток при расчетной терапевтической концентрации. Резистентны­ми считались образцы клеток, IC50 которых была выше медианного значения или выживаемость клеток при С_тер превышала средний показатель.

Результаты использования классического и мо­дифицированного методов на примере определе­ния лекарственной резистентности лимфоцитов в 54 образцах периферической крови пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ) к флударабелу представлены на рисунке и в таблице.

На рис. А показана зависимость изменения вы­живаемости клеток ХЛЛ от дозы флударабела для классического варианта МТТ-теста. Медианное значение IC50 составило 3 мкг/мл, разброс значе-IC значе­ний в 25-75 персентилях от 0,2 до 19 мкг/мл. Рези­стентными к флударабелу считали образцы клеток, IC50 которых была выше медианного значения.

При принятой С_тер флударабела 5 мкг/мл, ко­торая достоверно не отличалась от рассчитанной IC50 (p>0,05), медиана выживаемости составила 41% (28-61%) жизнеспособных клеток (рис. Б). Соответственно образцы, в которых выживаемость клеток превышала медианное значение, оценива­лись как резистентные, а группа, в которой жизне­способность лимфоцитов была ниже, - классифи­цировалась как чувствительная.

Сопоставление данных двух методик опреде­ления резистентности представлено в таблице со­ответствий.

Таблица

По обоим методам общее количество чувстви­тельных и резистентных к препарату образцов клеток составляло 33 и 21. Однако при сравнении результатов, полученных по различным методи­кам, для каждого отдельного случая установлено, что 2 образца лимфоцитов по их лекарственной чувствительности могли быть отнесены к различ­ным группам. Как видно из таблицы, определение случаев резистентности и чувствительности в ис­следованных модификациях МТТ-теста совпадает более чем на 90%, что подтверждено статистиче­ски с помощью критерия Хи-квадрат (χ² = 38,5, p<0,00001). Аналогичные результаты получены для другого отечественного аналога пуриновых нуклеозидов - лейкладина.

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что предложенный модифицированный вариант оценки лекарственной устойчивости является не менее точным, чем классический. Учитывая его преимущества, можно рекомендовать применение модифицированного МТТ-теста в доклинической диагностике лекарственной устойчивости паци­ентов с онкогематологическими заболеваниями, а также разрабатывать на основе данного метода тест-систему для скринингового определения ле­карственной чувствительности.