Цель работы - оценить значимость экспрес­сии гена множественной лекарственной устойчи­вости MDR1/ABCB1 в лимфоцитах пациентов с В-клеточным хроническим лимфоцитарным лейко­зом (В-ХЛЛ) для прогнозирования ответа лейкозных клеток на противоопухолевые препараты in vitro.

Сущность достижения заключается в обнару­жении факта отсутствия строгой количественной связи между экспрессией мРНК MDR1 в лимфо­цитах при ХЛЛ, содержанием белка-продукта этого гена и множественной лекарственной рези­стентностью клеток in vitro.

Новизна полученных данных состоит в том, что ответ на терапевтические воздействия in vitro лей­козных лимфоцитов при ХЛЛ не может однознач­но определяться экспрессией гена множественной лекарственной устойчивости MDR1.

Ген множественной лекарственной резистент­ности MDR1 кодирует белок Р-гликопротеин, функция которого напрямую связывается с устой­чивостью к ряду препаратов (доксорубицин, вин­кристин, этопозид) в опухолевых клетках. Для детекции белка P-гликопротеина на поверхности лейкозных лимфоцитов использовали монокло­нальные антитела к P-gp 170 (клон 17F9) (BD Pharmingen, США), меченные красителем флуо­ресцеин изотиоцианатом (FITC). Анализировали не менее 10000 клеток в каждом образце с ис­пользованием программы CellQuestPro. Уровень опре­деляли методом относительной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реально­го времени по отношению к экспрессии данного гена в клеточной линии IM-9. Для нормализации количества кДНК, вносимой в реакцию, исполь­зовали нормальный ген GUS. Амплификацию проводили в конечном объеме реакционной сме­си, равном 25 мкл и содержащем кДНК, Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogene), ко­нечная концентрация MgCl₂ была повышена до 4 мМ, 300 нМ каждого из праймеров и 200 нМ Taq-Taq­Man. Чувствительность к лекарственным препара­там определяли с помощью цитотоксического теста с 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ, Sigma). При статистической обра­ботке использовали непараметрические методы, т. к. распределение полученных параметров отличалось от нормального. Результаты представлены в виде медианы, в скобках указаны 25-75 персентили.

Экспрессию гена MDR1 оценивали в 20 об­разцах лейкозных лейкоцитов. Содержание мРНК MDR1 в исследованных образцах варьировало в значительной степени от 12 до 8583 отн. ед. Не выявлено достоверных различий между экспрес­сией данного гена в клетках пациентов, не полу­чавших терапию, и в клетках больных ХЛЛ после лечения, соответственно 359 (155-744) против 853 (193-954) отн. ед.

При исследовании зависимости между экс­прессией гена MDR1 и количественным содержа-MDR содержане установлено, что количество белка на поверх­ности клеток коррелирует с содержанием мРНК гена, кодирующего Р-гликопротеин.

При анализе содержания мРНК MDR1 в лим­фоцитах при ХЛЛ, чувствительных и устойчивых к химиопрепаратам (табл.), показано увеличенное содержание мРНК MDR1 в клетках, резистент­ных к хлорамбуцилу. Для других исследованных цитостатических препаратов, в т. ч. и для непо­средственных субстратов P-гликопротеина, ста­тистически значимых различий установлено не было. Корреляционный анализ по Спирману так­же не выявил зависимости между экспрессией гена MDR1 и чувствительностью клеток к моно- и комбинированным воздействиям цитостатиков in vitro (p>0,05).­

Таблица

Таким образом, одновременно с отсутствием корреляционной зависимости между экспрессией белка Р-гликопротеина и гена MDR1 количество копий мРНК гена MDR1 не определяет резистент­ность лейкозных клеток к специфическим суб­стратам P-гликопротеина in vitro.