Экспрессия гена множественной лекарствен­ной устойчивости (МЛУ) (multidrug resistance gene - MDR1) часто связана с клинически не­благоприятным прогнозом онкогематологических заболеваний. Как известно, метилирование ДНК в регуляторно-промоторной области гена часто ведет к инактивации данного гена и наоборот. Ярким примером последней ситуации является связь между гипометилированием гена MDR1 и повышением его экспрессии. За последние годы установлено, что возникновение и прогрессию неопластических заболеваний определяют не только классические генетические изменения, но и изменения, связанные с метилированием ДНК. В процессе лечения лейкозов происходит селекция лейкемических клеток, резистентных к противоопухолевым препаратам. Доминирующим фактором развития такой устойчивости является повышенная транскрипционная активность гена МЛУ (MDR1), кодирующего мембранный белок - P-гликопротеин (pgp-170).

Нами исследована динамика изменений харак­тера метилирования регуляторно-промоторной области гена MDR1 в сопоставлении с клинико-лабораторной картиной заболевания, иммунофе­нотипической экспрессией белка pgp-170 и экс­прессией MDR1 гена у больных разными видами лейкемий в сопоставлении с картиной метилиро­вания у здоровых доноров, а также в клеточных культурах.

В данной работе использовались методы крат­косрочных культур клеток, иммунофенотипиро­вания, метилчувствительная полимеразных цепей реакция (МЧ-ПЦР), обратно-транскриптазная по­лимеразных цепей реакция (ОТ-ПЦР), электоро­форез ДНК в агарозе с последующим сканирова­нием геля.

В качестве исходного материала для выделе­ния ДНК были использованы лейкоциты перифе­рической крови и ядросодержащие клетки кост­ного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в различных стадиях заболевания. Было исследовано 17 образцов ДНК больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), 18 образцов ДНК больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и 18 образцов ДНК больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ). В качестве контроля ис­пользовались образцы ДНК периферической кро­ви 20 здоровых доноров. Во всех случаях диагноз подтверждался морфологическими, цитохими­ческими методами и методом иммунофенотипи­рования. Для анализа экспрессии белка pgp-170 использовались антитела фирмы Caltag (США). В качестве материала для выделения ДНК при­менялись как цельные, так и фракционированные (с использованием фикол-верографинового гради­ента с плотностью 1,077) препараты крови и кост­ного мозга. Кроме того, нами исследован характер метилирования регуляторно-промоторного регио­на 5’-области MDR1 гена в 3-суточной культуре клеток донорских лимфоцитов и химиорезистент­ных клеточных линий, стимулированных и не сти­мулированных фитогемагглютинином (ФГА).

Около 500 нг ДНК инкубировали с 25 ЕД ре­стрикционной эндонуклеазы HpaII (чувствительной к метилированию ДНК) или MspI (не чувствитель­ной к метилированию ДНК) в течение 16-18 ч при 37°C. Полученные образцы использовали в ПЦР.

Праймеры для метилчувствительной полиме­разных цепей реакции (МЧ-ПЦР)

Синтезированы праймеры к MD1, MD2 и MDC - фрагментам 5′-промоторной области MDR 1 гена с целью выполнения метилчувствительной полимеразных цепей реакции (МЧ-ПЦР).

Синтезированы праймеры к MD1, MD2 и MDC - фрагментам 5′-промоторной области MDR1-гена с целью выполнения метилчувствительной полимеразных цепей реакции (МЧ-ПЦР). Это 5′-праймеры к MD1-области: MD1/5 5′-TCT AgA gAg gTg CAA Cgg AAg - 3′ MD1/3 5′-TCA gCC TCA CCA CAg ATg AC- 3′ (120 пар нуклеотидов (пн); и к MD2-области 5′-промоторной области MDR-1-гена: MD2/5 5′-TgA AgT CCT CTg gCA AgT CC- 3; MD2/3 5′-ATT CTC CCT CCC ggT TCC-3′ (210 пн). В качестве контроля синтезированы праймеры, к участку промоторной области, MDR1-гена, не содержащей CpG-последовательностей и, следовательно, не подверженной гидролизу HpaII/MspI рестрикционным эндонуклеазами: MDC5 5′- ATT TCA CgT CTT ggT ggC C - 3′ MDC3 5′- TCC AgT gCC ACT ACg gTT Tg -3′ (240 пн.). Параметры МЧ-ПЦРДля анализа состояния метилирования 5′-промоторной области MDR1-гена в реакции (общий объем реакции - 5 мкл) использовали праймеры в концентрации 1 мкмоль/л. МЧ-ПЦР выполняли в течение 30 циклов: 1-й цикл: 95°С - 3 мин, 57°С - 1 мин и 72°С - 2 мин. Циклы 2-30: 95°С - 30 с, 60°С - 30 с и 72°С - 10 мин. 8-10 мкл реакционной смеси вносили в лунку с 2%-м агарозным гелем. Затем гель окрашивали этидиум-бромидом, фотографировали и сканировали в гель-документирующем устройстве.

Обратно-транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР)

РНК выделяли из ядросодержащих клеток (лейкоцитов) здоровых доноров (контрольные об­разцы), а также из ядросодержащих клеток пери­ферической крови и костного мозга больных гемо­бластозами.

Одноцепочечную кДНК синтезировали из примерно 1 мкг ДНК с использованием обрат­ной транскриптазы вируса лейкемии Молони (Moloney), рандом-праймера и ингибитора РНК. Последующую ПЦР выполняли в объеме 10 мкл, содержащем эквивалентное 100 нг РНК количе­ство кДНК, 1 мкмоль/л каждого из праймеров гена MDR1 и β₂-микроглобулина в качестве контроля. Реакцию для каждого гена выполняли отдельно.

Были использованы следующие праймеры:

MDR1 5′-CACGTGGTTGGAAGCTAACC-3′ 5′-GAAGGCCAGAGCATAAGATGC-3′ β₂-микроглобулин 5′-GTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGC-3′ 5′- TTCACTCAATCCAAATGCGGCATCTTC-3

Часть экспериментального этапа работы вы­полнена в лаборатории генной инженерии филиа­ла Института биоорганической химии Российской академии наук. Результаты исследований суммированы в таблице.

Таблица

Метилирование 5’-области гена mdr-1 и экспрессия мРНК в клетках донорских лимфоцитов и резистентных клеточных линий

Вид клеток	Количество наблюдений	Статус	Уровень Pgp-170	Метилирование MDR1 гена	Экспрессия MDR1 гена
Донорские лимфоциты	10	Интактные клетки	0	+	–
Донорские лимфоциты	10	3-дневный контроль без стимуляции	0	–	+
Донорские лимфоциты	10	3-дневная стимуляция ФГА 5 мг	0	–	++++
Донорские лимфоциты	10	3-дневная стимуляция ФГА 10 мг	0	–	++++
Донорские лимфоциты	10	3-дневная стимуляция ФГА 25 мг	0	–	-/+
IM 9	5	нерезистентная линия	0	–	++++
IM 9 Fl	5	линия, резистентная к флударабину	0	–	+
IM 9 Vcr	5	линия, резистентная к винкристину	0	–	+
IM 9 Tax	5	линия, резистентная к таксатеру	0	–	–
IM 9 Fl +	5	линия, резистентная к флударабину с 3-дневной стимуляцией Fl	0	–	+
IM 9 Vcr +	5	линия, резистентная к винкристину с 3-дневной стимуляцией Vcr	0	–	+++
IM 9 Tax +	5	линия, резистентная к таксатеру с 3-дневной стимуляцией Tax	0	–	+++

Полученные данные свидетельствуют, что вы­сокие показатели транскрипционной активности в большинстве случаев соответствуют низкому уровню метилирования CpG-последовательностей регуляторно-промоторной области MDR1. Ин­тересно отметить высокий уровень экспрессии мРНК MDR1 гена в донорских лимфоцитах в куль­туре даже без стимуляции фитогемагглютинином в отличие от уровня такового в интактных клет­ках. Этот показатель превышает таковой даже в сравнении с уровнем некоторых резистентных клеточных линий (табл.). В то же время высокие концентрации фитогемагглютинина подавляют транскрипционную активность гена MDR1, что может быть связано с токсическим воздействи­ем на клетки (таблица). В 3-суточных культурах экспрессия pgp-протеина на мембранах как до­норских лимфоцитов, так и клеток резистентных линий не определялась.

При острых лейкозах и хроническом миелоид­ном лейкозе уровень экспрессии белка pgp коле­бался от 0,03 до 40%, увеличиваясь по мере прогрессии заболевания. Как известно, pgp-протеин является филогенетически древним белком, обе­спечивающим удаление токсических веществ из клетки с помощью калий-натриевого насоса и, ве­роятно, именно это преимущество pgp-активности у здоровых клеток зачастую обеспечивает успех противоопухолевой терапии на начальных этапах лечения лейкемии. Схожая динамика отмечена и при исследовании РНК-экспрессии гена MDR1. В то же время уровень метилирования 5′-области гена MDR1 последовательно уменьшался. Ранее нами было установлено, что в большинстве случа­ев ХМЛ существует обратная корреляция между уровнем метилирования MDR1 гена и степенью прогрессии заболевания. Оптическая плотность продуктов MЧ-ПЦР с MD1 и MD2-парами прай­меров (фрагменты ДНК размером 120 и (или) 210 пн), полученная при сканировании геля после ПЦР была максимальной у здоровых доноров и досто­верно понижалась в образцах ДНК больных ХМЛ по мере прогрессии болезни. Это свидетельствует о метилировании 5′-CCGG-последовательностей внутри сайтов MD1 и MD2 у здоровых доноров и снижении уровня метилирования 5′-промоторной области в ДНК больных. Такие результаты были получены со всеми образцами ДНК перифери­ческой крови здоровых доноров. Также выпол­нена МЧ-ПЦР с контрольной парой праймеров к 5′-промоторной области гена MDR1, не содер­жащей CCGG-сайтов (MDC). Во всех случаях нормы и патологии амплифицировался контроль­ный фрагмент 5′-промоторной области гена MDR1 размером 240 пн, оптическая плотность которого менялась незначительно во всех исследованных образцах ДНК. При ПЦР-анализе образцов ДНК, подвергшихся гидролизу MspI, также амплифици­ровался только контрольный фрагмент, т.к. «рабо­чие» фрагменты ДНК, содержащие CCGG-сайты (по которым и метилируется цитозин у человека), подверглись полному гидролизу. Деметилирова­ние 5′-промоторной области гена MDR1 часто коррелирует с экспрессией самого гена, что, ве­роятно, связано с селекцией резистентного клона лейкозных клеток с фенотипом множественной лекарственной устойчивости в процессе лечения лейкемий.­

Также обращает на себя внимание большее снижение уровня метилирования 5′-области MDR1 гена (и, соответственно, повышение уровня транскрипционной активности MDR1 - мРНК) при лейкозах миелоидного ряда по сравнению с образцами ДНК/РНК больных ОЛЛ. Особенно характерно деметилирование и нарастание экс­прессии мРНК по мере прогрессии ХМЛ. Анало­гичная корреляция наблюдается и у больных остры­ми лейкозами (и особенно при ОМЛ). Она не столь выражена, хотя тенденция остается прежней. Полу­ченные данные свидетельствуют, что приобретение фенотипа множественной лекарственной устойчи­вости характерно для больных лейкемиями и более для ХМЛ и лейкозов миелоидного ряда, нежели для ОЛЛ. Этот процесс напрямую связан с эпигенетиче­ской модификацией (метилированием) ДНК.

В данном исследовании проанализированы возможности применения метилчувствительной полимеразных цепей реакции для выявления па­тологического метилирования отдельных генов на примере метилирования 5′-промоторной области гена MDR1 в норме и при лейкозах. Как показано, ген MDR1 имеет прямое отношение к ответу на химиотерапию онкогематологических заболева­ний, а деметилирование ДНК в его регуляторно-промоторной области, как правило, коррелирует с экспрессией гена и может служить ранним марке­ром селекции опухолевого клона, резистентности к терапии и опухолевой прогрессии. Применение такого маркера в сочетании с другими генами-маркерами метилирования (ген кальцитонина и др.) позволит в перспективе создать специфическую панель метилирования для улучшения точности прогноза и рациональной модификации терапии опухолевых заболеваний системы кроветворения. Перспективно также использование данного ме­тода в оценке контаминации трансплантата при пересадке гемопоэтических стволовых кроветвор­ных клеток.

Патентная защита: готовится заявка.