Многочисленные исследования как в нашей стране, так и за рубежом свидетельствуют о том, что бактерии, особенно обитающие в больничных экосистемах, способны формировать устойчивость к используемым в практике дезинфицирующим средствам. Формирование и распространение во внутрибольничной среде устойчивых к дезинфектантам бактерий приводит к снижению эффективности дезинфекционных мероприятий, что требует постоянного контроля над возникновением и циркуляцией резистентных к дезинфицирующим препаратам вариантов микроорганизмов.

В связи с этим Минздравом РБ принят ряд нормативных документов, обязывающих лечебно-профилактические учреждения периодически (не реже одного раза в квартал) проводить исследования по определению чувствительности к дезинфектантам бактерий, выделенных из патологического материала пациентов и объектов внешней среды. Полномасштабное введение такого контроля возможно при наличии доступного для широкого практического применения метода, дающего возможность регистрации и оценки этого явления. Широко применяемые на практике качественный и количественный суспензионный методы были разработаны и применяются для оценки эффективности дезинфектантов, в т. ч. с целью их регистрации. Их выполнение требует больших временных и материальных затрат, и нецелесообразно при выполнении массовых скрининговых исследований для выявления устойчивых к дезинфектантам эковаров бактерий.

Целью работы является создание скринингового метода и тест-системы, применение которых позволит выполнять объемные, массовые и стандартные исследования по выявлению устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий, осуществлять контроль их циркуляции в больничной среде.

В основе разработанного с применением тест-системы микрометода определения устойчивости бактерий к дезинфектантам лежит принцип регистрации роста (устойчивости к дезинфектанту) исследуемой бактериальной культуры, основанный на изменении цвета питательной среды с редокс-индикатором.

Данный метод позволяет значительно (более чем в 10 раз) снизить расход питательной среды и нейтрализатора, выполняется в один этап - без высева исследуемых бактерий на плотные питательные среды, значительно сокращает время работы благодаря использованию многоканальной пипетки для переноса ингредиентов.

Тест-система представляет собой стерильную пластмассовую 96-луночную (объем лунок 0,2 мл) планшету разового использования с крышкой и содержащимися в ее лунках сухими субстратами (см. рисунок).

Рис. 1. Исходная планшета (тест-система). Условные обозначения:

Четыре вертикальных ряда лунок (1, 4, 7, 10) не содержат ингредиентов; четыре ряда (2, 5, 8, 11) содержат универсальный сложный нейтрализатор дезинфектантов, находящийся в высушенном состоянии, и четыре ряда (3, 6, 9, 12) - сухую питательную среду с индикатором. Перед исследованием на крышке либо самой планшете с лунками выполняется «разметка» с учетом выбранного варианта постановки опыта. Цифровые и буквенные обозначения по боковому и верхнему краю планшеты даны как система координат, позволяющая применять секторный принцип проведения исследований и учета результатов. После этого в ряды лунок с высушенными универсальным нейтрализатором и питательной средой с индикатором 8-канальной пипеткой вносится по 100,0 мкл стерильной дистиллированной воды для растворения сухих ингредиентов. В ряды пустых лунок вносится по 100,0 мкл дезинфицирующих средств в рабочих и прочих концентрациях. В лунки с раствором дезинфектантов вносится исследуемая бактериальная культура, которая после определенной экспозиции переносится в раствор нейтрализатора, а затем также после определенной экспозиции в нем переносится в жидкую питательную среду с индикатором.

Учет и интерпретация результатов осуществляется после инкубации тест-систем в термостате при 37 °С в течение 18-24 ч. Наличие в питательной среде редокс-индикатора позволяет зарегистрировать размножение бактерий (в случае сохранения их жизнедеятельности после воздействия дезинфектанта) по изменению цвета среды. Опыт сопровождается постановкой контролей, которые выполняются в этой же тест-системе.

Использование при проведении исследования нескольких концентраций дезинфектантов позволяет выявить не только варианты бактерий, устойчивых к рабочим концентрациям, но и более низким, что может свидетельствовать о процессе формирования устойчивых вариантов.