Разработка пермиссивной системы репродукции вируса гепатита А (ВГА) является важным условием для выпуска отечественных диагностических и профилактических препаратов в отношении гепатита А (ГА). Целесообразность этой разработки основывается на определяющей роли вируса и полученных на его основе антигенов в изготовлении вакцин, лактоиммуноглобулина, диагностических препаратов. ВГА относится к трудно и длительно культивируемым вирусам. В мире насчитывается лишь несколько пермиссивных систем его репродукции. Культивирование этого возбудителя требует значительных материальных затрат и времени, что обуславливает высокую стоимость антигена, которая в значительной мере определяет и стоимость производимых на его основе иммунобиологических препаратов. В течение ряда лет антиген ВГА, используемый в отечественном производстве диагностических препаратов и лактоиммуноглобулина против вирусного гепатита А, импортировался.

Цель исследования - разработка отечественной пермиссивной системы культивирования ВГА, создание на этой основе импортозамещающих технологий получения антигена ВГА, который необходим для изготовления диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов в отношении ГА, а также внедрение результатов НИР в производство этих препаратов.

Важным этапом работы являлся отбор ВГА-содержащих проб, наиболее подходящих для адаптации вируса к культуре клеток. С этой целью использовалась разработанная ранее в лаборатории методика антигенсвязывающей ПЦР (АС-ПЦР) и соответствующий коммерческий набор (АС-ПЦР ВГА). Эта методика позволяет выявлять вирионы, имеющие одновременно два основных маркера - антиген и геном, т. е. вирионы, которые с большой долей вероятности сохраняют свою морфологическую и функциональную, в т. ч. инфекционную, активность. Методом АС-ПЦР исследовано 6 фекальных проб, полученных ранее от больных ГА и контактировавших с ними лиц, и 1 изолят, выделенный из пробы фекалий от так называемого контактного лица, прошедший 4 последовательных пассажа в культуре клеток. Указанные пробы были позитивными на наличие антигена ВГА методом ИФА. Результаты исследований методом АС-ПЦР показали, что из 7 позитивных в ИФА проб, положительными оказались 4. При этом одна из них (изолят № 707) имела наиболее высокую концентрацию вируса по сравнению со всеми исследованными пробами.

Проведены последовательные пассажи 5 предварительно отобранных проб, содержащих инфекционный возбудитель ГА в наибольших концентрациях, в т. ч. 2 пробы сывороток крови и 3 пробы фекалий. Положительные результаты по репродукции вируса были получены в процессе серийного пассирования 2-х образцов фекальных проб.

С целью масштабирования процесса получения антигена ВГА была проведена серия пассажей этих образцов на роллерных флаконах объемом 500 мл. В результате был отобран изолят № 707, который стабильно репродуцировался в культуре клеток и мог быть использован как производственный штамм для приготовления иммунобиологических препаратов. Полученному штамму был присвоен индекс HAV-707.

Филогенетический анализ производственного штамма HAV-707 показал, что он относится к субгенотипу 1А - наиболее распространенному на земном шаре - и располагается в одной группе со штаммом HAS-15 и кубинским штаммом М2. При этом он имеет две замены в нуклеотидной последовательности, отличающие его от HAS-15 (положение 3272 и 3312), и одну - от М2 (положение 3168).

Штамм депонирован в национальной коллекции патогенных для человека микроорганизмов.

Таким образом, проведено 15 последовательных пассажей вируса гепатита А на культуре клеток почки эмбриона макаки-резус FRhK-4. Инфекционная активность вируса в исходной вируссодержащей суспензии, полученной на 21-е сут культивирования при еженедельной смене среды, характеризовалась величиной 10-4,5 TCID/мл и не менее 6-7 lg ИЕ в мл. Антигенная активность по величине показателя оптической плотности в ИФА составляла в лизатах 1.215-1.505 о.е., в надосадочных жидкостях - от 0.2 до 0.6 о.е. За период исследований было получено 240 мл вируссодержащей суспензии с показателем оптической плотности в ИФА от 0.5 до 1.6 о.е.

Антиген ВГА получали путем объединения вируссодержащих жидкостей с показателем оптической плотности в ИФА более 1.0 о.е.

Инактивация вируса проводилась раствором нейтрального формалина в конечной концентрации 0,5% при 37 °С в течение 18 ч. Полнота инактивации ВГА контролировалась путем трехкратного пассирования инактивированного вируса в культуре клеток FRhK-4. После проведения 3-х «слепых» пассажей РНК ВГА не обнаруживалась ни в лизатах клеток, ни в надосадочных жидкостях.

За время проведения исследований были получены 2 экспериментальные серии антигена вируса гепатита А с показателем оптической плотности в ИФА 1.2 и 1.5 о.е.

Таким образом, определены основные параметры и разработана пермиссивная система культивирования производственного штамма ВГА. Разработаны лабораторный регламент и Технические условия на получение антигена ВГА. Организовано производство антигена ВГА.

Вид патентной защиты: подана заявка на изобретение «Штамм virus hepatitis А HAV-707 для получения антигена и изготовления профилактических и диагностических препаратов» (№ а20080310 от 17.03.08).