УДК: 616.36-002.14:578.891]:615.37
Год издания: 2009

Пермиссивная система культивирования вируса гепатита А как продуцент вирусного антигена для изготовления иммунобиологических препаратов

Виринская А.С.Ефимов А.В.Плотникова К.Ю.Гудков В.Г.
Рубрики: 34.25.19
Научно-исследовательский институт эпидемиoлогии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать и внедрить пермиссивную систему культивирования вируса гепатита А для получения антигена и изготовления профилактических и диагностических препаратов».
Сроки выполнения НИР: январь 2006 г. — декабрь 2008 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук В.Г. Гудков.
Источник финансирования: госбюджет.

Разработка пермиссивной системы репродукции вируса гепатита А (ВГА) является важным условием для выпуска отечественных диагностических и профилактических препаратов в отношении гепатита А (ГА). Целесообразность этой разработки основывается на определяющей роли вируса и полученных на его основе антигенов в изготовлении вакцин, лактоиммуноглобулина, диагностических препаратов. ВГА относится к трудно и длительно культивируемым вирусам. В мире насчитывается лишь несколько пермиссивных систем его репродукции. Культивирование этого возбудителя требует значительных материальных затрат и времени, что обуславливает высокую стоимость антигена, которая в значительной мере определяет и стоимость производимых на его основе иммунобиологических препаратов. В течение ряда лет антиген ВГА, используемый в отечественном производстве диагностических препаратов и лактоиммуноглобулина против вирусного гепатита А, импортировался.

Цель исследования - разработка отечественной пермиссивной системы культивирования ВГА, создание на этой основе импортозамещающих технологий получения антигена ВГА, который необходим для изготовления диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов в отношении ГА, а также внедрение результатов НИР в производство этих препаратов.

Важным этапом работы являлся отбор ВГА-содержащих проб, наиболее подходящих для адаптации вируса к культуре клеток. С этой целью использовалась разработанная ранее в лаборатории методика антигенсвязывающей ПЦР (АС-ПЦР) и соответствующий коммерческий набор (АС-ПЦР ВГА). Эта методика позволяет выявлять вирионы, имеющие одновременно два основных маркера - антиген и геном, т. е. вирионы, которые с большой долей вероятности сохраняют свою морфологическую и функциональную, в т. ч. инфекционную, активность. Методом АС-ПЦР исследовано 6 фекальных проб, полученных ранее от больных ГА и контактировавших с ними лиц, и 1 изолят, выделенный из пробы фекалий от так называемого контактного лица, прошедший 4 последовательных пассажа в культуре клеток. Указанные пробы были позитивными на наличие антигена ВГА методом ИФА. Результаты исследований методом АС-ПЦР показали, что из 7 позитивных в ИФА проб, положительными оказались 4. При этом одна из них (изолят № 707) имела наиболее высокую концентрацию вируса по сравнению со всеми исследованными пробами.

Проведены последовательные пассажи 5 предварительно отобранных проб, содержащих инфекционный возбудитель ГА в наибольших концентрациях, в т. ч. 2 пробы сывороток крови и 3 пробы фекалий. Положительные результаты по репродукции вируса были получены в процессе серийного пассирования 2-х образцов фекальных проб.

С целью масштабирования процесса получения антигена ВГА была проведена серия пассажей этих образцов на роллерных флаконах объемом 500 мл. В результате был отобран изолят № 707, который стабильно репродуцировался в культуре клеток и мог быть использован как производственный штамм для приготовления иммунобиологических препаратов. Полученному штамму был присвоен индекс HAV-707.

Филогенетический анализ производственного штамма HAV-707 показал, что он относится к субгенотипу 1А - наиболее распространенному на земном шаре - и располагается в одной группе со штаммом HAS-15 и кубинским штаммом М2. При этом он имеет две замены в нуклеотидной последовательности, отличающие его от HAS-15 (положение 3272 и 3312), и одну - от М2 (положение 3168).

Штамм депонирован в национальной коллекции патогенных для человека микроорганизмов.

Таким образом, проведено 15 последовательных пассажей вируса гепатита А на культуре клеток почки эмбриона макаки-резус FRhK-4. Инфекционная активность вируса в исходной вируссодержащей суспензии, полученной на 21-е сут культивирования при еженедельной смене среды, характеризовалась величиной 10-4,5 TCID/мл и не менее 6-7 lg ИЕ в мл. Антигенная активность по величине показателя оптической плотности в ИФА составляла в лизатах 1.215-1.505 о.е., в надосадочных жидкостях - от 0.2 до 0.6 о.е. За период исследований было получено 240 мл вируссодержащей суспензии с показателем оптической плотности в ИФА от 0.5 до 1.6 о.е.

Антиген ВГА получали путем объединения вируссодержащих жидкостей с показателем оптической плотности в ИФА более 1.0 о.е.

Инактивация вируса проводилась раствором нейтрального формалина в конечной концентрации 0,5% при 37 °С в течение 18 ч. Полнота инактивации ВГА контролировалась путем трехкратного пассирования инактивированного вируса в культуре клеток FRhK-4. После проведения 3-х «слепых» пассажей РНК ВГА не обнаруживалась ни в лизатах клеток, ни в надосадочных жидкостях.

За время проведения исследований были получены 2 экспериментальные серии антигена вируса гепатита А с показателем оптической плотности в ИФА 1.2 и 1.5 о.е.

Таким образом, определены основные параметры и разработана пермиссивная система культивирования производственного штамма ВГА. Разработаны лабораторный регламент и Технические условия на получение антигена ВГА. Организовано производство антигена ВГА.

Вид патентной защиты: подана заявка на изобретение «Штамм virus hepatitis А HAV-707 для получения антигена и изготовления профилактических и диагностических препаратов» (№ а20080310 от 17.03.08).


Область применения: производство иммунобиологических препаратов.
Рекомендации по использованию: полученный продукт использован в качестве одного из основных компонентов при изготовлении 360 наборов сложных диагностических препаратов согласно госзаказу. Получен начальный эффект импортозамещения на сумму 23000,0 долларов США по цене предыдущей закупки антигена. Получен акт внедрения разработки в производство.
Предложения по сотрудничеству: реализация по конкурентным ценам готовой продукции: антигена ВГА, иммуноферментных диагностических препаратов в отношении ГА; организация совместного производства лактоиммуноглобулина против вирусного гепатита А, вакцины против вирусного гепатита А.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта