Существенную проблему для здравоохранения продолжают представлять острые вирусные респираторные инфекции (ОРВИ), которые ежегодно регистрируются и составляют около 90% общей инфекционной патологии. Этиологическое многообразие инфекций, объединяемых термином «ОРВИ», а также сходство клинических проявлений затрудняет их диагностику и адекватный мониторинг. Этим подчеркивается экономическая значимость системы санитарно-эпидемиологического надзора за гриппом и другими ОРВИ. Своевременное выявление возбудителя является основным условием высокой эффективности проводимых лечебно-профилактических мероприятий.

Наиболее распространенным методом экспресс-диагностики ОРВИ, доступным для массового обследования населения в нашей стране, является МФА (метод флюоресцирующих антител). Для его проведения необходимы флюоресцирующие антисыворотки к антигенам вирусов, которые в республике не производятся и закупаются, как правило, в России в виде монопрепаратов для каждой инфекции отдельно.

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы состояла в разработке технологии получения диагностического набора для дифференциальной диагностики гриппа и других ОРВИ методом флюоресцирующих антител.

Для решения поставленной задачи проведен подбор экспериментальных систем «вирус-культура клеток» для накопления вирусов и получения антигенов, в качестве которых были отобраны следующие системы: ФЭК (фибробласты эмбрионов кур), RD и HEP-2с. В работе использовали вирусы гриппа А с антигенными формулами H1N1 (А/Техас/1/82) и H3N2 (А/Aichi/2/68 и А/Минск/65/05), вирус гриппа В/Минск/88/05, вирусы парагриппа 3 типа, респираторно-синцитиальный вирус (штамм Long), аденовирусы 4-х серотипов (1, 3, 5, а также нетипированный аденовирус, выделенный в республике). Видовая и антигенная принадлежность размноженного вируссодержащего материала подтверждена в реакциях гемагглютинации, нейтрализации и методом флюоресцирующих антител с коммерческими флюоресцирующими антисыворотками российского производства. Накопленный вируссодержащий материал, очищенный от клеточного детрита, использовали в качестве антигенов для иммунизации лабораторных животных. Разработаны индивидуальные схемы иммунизации белых беспородных мышей и мышей линии BALB/с, позволившие получить иммунно-асцитическую жидкость (ИАЖ) с титром антител ко всем вирусам 1:512 - 1:1024.

Для выделения глобулинов использовали несколько модификаций известных методов: солевой, спиртовой, риванольно-спиртовой. Результаты выполненной работы показали, что все использованные методы позволяют получить иммуноглобулин с удельной специфической активностью на 1-2 разведения выше, чем в исходной ИАЖ. Показано, что наиболее оптимальным методом является спиртовой, которым получено по 3 серии иммуноглобулинов к исследуемым вирусам. Иммуноглобулины с титром не ниже 1:1024 использовали для метки флюорохромом (ФИТЦ) с последующей гельфильтрацией на колонках с сефадексом G-50 для высвобождения избытка красителя, не связавшегося с белком.

Специфическую активность меченых глобулинов определяли в общепринятой постановке прямым МФА на слайдах с клетками, инфицированными исследуемыми вирусами. Для определения красящего титра меченых глобулинов клетки Hep-2 снимали для приготовления слайдов на 3-и сутки после инфицирования. Меченые глобулины исследовали в разведениях от 1:8 до 1:32. Красящий титр меченых глобулинов к вирусам гриппа А (H1N1) и В составил 1:32, к вирусу гриппа А (H3N2), аденовирусам, РС-вирусу и вирусу парагриппа - 1:16.

Таким образом, разработана технология получения набора для дифференциальной диагностики гриппа и других ОРВИ методом флюоресцирующих антител, включающая оптимальные методы получения иммуноглобулинов, их метку ФИТЦ и гель-фильтрационную очистку. Такая технология обеспечила получение препаратов для прямого МФА, позволяющих идентифицировать вирусы в зараженных культурах клеток и в материале от больных.