Лептоспироз занимает ведущее место в структуре природно-очаговых инфекций и представляет серьезную опасность для здоровья населения. Заболевание вызывают микроорганизмы из рода Leptospira interrogans, объединенные в настоящее время в 23 серогруппы и включающие более 200 сероваров. Инфекция широко распространена во всем мире. Клиника лептоспироза характеризуется выраженным полиморфизмом, цикличностью и различной степенью тяжести - от легких, стертых до крайне тяжелых форм. В период разгара болезни выражены поражения печени, почек, легких, сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, есть признаки генерализованного капилляротоксикоза и нарушения в системе гемостаза. Летальность при лептоспирозе зависит от многих причин и в разных странах колеблется от 5 до 48%. Непосредственной причиной смерти является токсико-инфекционный шок, острая почечная недостаточность. Полиморфизм клинической картины, сочетание синдромов или преобладание одного из них определяет трудности в лабораторной диагностике лептоспироза, в постановке своевременного диагноза, оценке тяжести состояния больного и прогнозировании исхода заболевания.

Снижение уровня официальной заболеваемости лептоспирозом в последние годы до 2-5 случаев в год определяет отсутствие настороженности у практических врачей в отношении данной инфекции. В то же время ландшафтно-климатические условия в республике способствуют функционированию активных природных очагов инфекции и циркуляции возбудителя в популяции населения. Недостаток точных эпидемиологических данных по лептоспирозу диктует необходимость проведения масштабных скрининговых исследований.

В настоящее время практически нет сведений о распространении и частоте встречаемости лептоспироза как у лиц из «групп риска», так и среди пациентов, имеющих схожую с лептоспирозом симптоматику заболевания и проходящих лечение в терапевтических, гастроэнтерологических, нефрологических, неврологических и других отделениях больниц и клиник, поскольку лабораторная диагностика данной инфекции среди них целенаправленно не проводится, в частности из-за отсутствия доступных и эффективных диагностических средств. Проведение эпизоотологического мониторинга лептоспирозной инфекции в Беларуси среди различных видов животных-лептоспироносителей в природных очагах тормозятся по аналогичной причине.

На практике лабораторная диагностика лептоспироза проводится с использованием реакции микроагглютинации (РМА) и непрямой реакции иммунофлюоресценции (нРИФ). Реакции имеют определенные недостатки, главными из которых являются трудоемкость, длительность, ограничения при выявлении противолептоспирозных антител вследствие замедленного иммуногенеза у заболевшего. Создание диагностической тест-системы, отличающейся высокой чувствительностью и специфичностью, простотой выполнения анализов и возможностью автоматизации получения результатов, исключающей субъективизм в оценке результатов, является актуальной и своевременной.

Цель исследования - разработка отечественной тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенной для серологической диагностики лептоспироза.

Нами была отработана технология приготовления лептоспирозного антигена, обладающего широким диапазоном анти- и иммуногенных свойств, получен положительный и отрицательный контрольный образец, оптимизированы условия взаимодействия «антиген-антитело», методика постановки ИФА, регистрации и анализа результатов.

Была создана иммуноферментная тест-система для выявления антител класса G к возбудителю лептоспироза Leptospira interrogans в сыворотке и плазме крови человека - «Лепто-ИФА-IgG». Комплектация тест-системы стандартная. Основой является иммуносорбент - стриповый планшет с иммобилизированным антигеном. Летоспирозный антиген представлен комплексным ультразвуковым дезинтегрантом, приготовленным из бактериальной суспензии трех серогрупп лептоспир (Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorragiae) путем трехкратной обработки ультразвуком при 35 кГц и акустической мощности до 100 кВт/см2 в течение 1 мин с последующим центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин.

Положительный контрольный образец (K+) получен путем объединения нескольких инактивированных (56 °С, 3 ч) сывороток крови переболевших лептоспирозом людей с высокими титрами противолептоспирозных антител класса G (титры в РМА не ниже 1:400). Отрицательным контрольным образцом (K-) служит сыворотка крови здорового человека, инактивированная прогреванием и не содержащая антител к НВsАg, ВИЧ и вирусу гепатита С. Конъюгат представлен моноклональными мышиными антителами против иммуноглобулинов G человека, конъюгированными с ферментом пероксидазой хрена. Хромоген - 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин. В состав тест-системы также входят 10-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-20 (ФСБ-Т) для промывания планшетов, разводящий буферный раствор для сывороток (РБР-С), разводящий буферный раствор для конъюгата (РБР-К) и стоп-реагент - 0,1н серная кислота.

Образующийся при реакции комплекс «антиген-антитело» определяют по появлению голубоватого окрашивания на этапе ферментного превращения субстратного раствора. Оценку результатов проводят по уровню поглощения (значение оптической плотности - ОП) при длине волны 450 нм. При этом ОПсреднее К+ должно быть не ниже 0,7, ОПсреднее К- не должно превышать 0,2, а ОП контроля конъюгата не должно быть выше 0,15.

Коэффициент серопозитивности (КС) анализируемой сыворотки, рассчитываемый путем деления значений ее ОП450 на ОПкрит, полученное по формуле ОПсреднее К- + 0,2, определяет сыворотку как «положительная», если КС 1,1, и как «отрицательная», если КС <0,9. Сомнительный результат или «серая зона» находится между значениями 0,9< КС <1,1.

Чувствительность и специфичность тест-системы определяли при исследовании 20 сывороток крови больных лептоспирозом с клиническим и лабораторно подтвержденным диагнозом (титры антител в РМА варьировали от 1:100 до 1:6400) и более 50 сывороток практически здоровых людей. Данные показатели составили >95%. В сравнительных исследованиях с аналогичной тест-системой российского производства («Лептоспироз-ИФА-IgG», пр-ва ООО «Омникс», С.-Петербург, РФ) установлено, что она не уступала зарубежному аналогу.

Диагностическую эффективность тест-системы изучили при анализе 358 сывороток людей с различными инфекционными заболеваниями и здоровых доноров. Исследования показали, что коэффициенты серопозитивности сывороток крови больных хламидиозом (98 образцов) колебались в пределах 0,49±0,03, трихомониазом (28 образцов) - 0,41±0,01, иерсиниозом (15 образцов) - 0,67±0,02, герпетическими инфекциями (56 образцов) - 0,44±0,03, гепатитом В (32 образцов) - 0,78±0,04 и здоровых доноров (56 образцов) - 0,38±0,04, т. е. были отрицательными. В «серой зоне» находились сыворотки больных сифилисом (40 исследованных сывороток с КС 0,93±0,1) и клещевым боррелиозом (33 исследованных сыворотки с КС 0,96±0,08). Учитывая спирохитозную этиологию данных заболеваний и во избежание получения ложноположительных результатов, при диагностике лептоспироза необходимо исключить из анализа материал от больных с диагнозами «клещевой боррелиоз» и «сифилис».

На диагностическую тест-систему разработан Лабораторный регламент и Технические условия на производство. Тест-система проходит регистрацию в Министерстве здравоохранения в соответствии с установленным порядком.