Прионные инфекции (синоним трансмиссивные губкообразные энцефалопатии - ТГЭ) включают группу прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы человека и животных, характеризующихся длительным инкубационным периодом и необратимыми спонгиоформными изменениями серого вещества головного мозга, приводящими к 100% летальному исходу. Патологические прионы, выявляемые при ТГЭ, образованы в значительной степени из аномального протеазоустойчивого прионного белка PrPres (от англ. resistant - устойчивый). Формирование PrPres, как полагают, является результатом конформационной перестройки клеточного прионного белка (PrPC), в норме выявляемого во всех тканях организма.

Инфекционность при ТГЭ обычно ассоциируют с наличием PrPres, поэтому в настоящее время все доступные коммерческие наборы, предназначенные для рутинной диагностики ТГЭ (главным образом у животных), базируются на его индикации. Существует несколько методов обнаружения PrPres, включая твердофазный иммуноферментный анализ, дот-блот, клеточный блот и Вестерн-блот (иммунный блоттинг). Однако только иммунный блоттинг в настоящее время является единственным методом, который одновременно может быть и количественным, и качественным. Метод позволяет избирательно обнаруживать как наличие каждой из двух гликоформ PrPres, так и определять молекулярный вес PrPC и PrPres. Электрофоретические профили, полученные при иммунном блоттинге, используются для характеристики штаммовых различий прионов.

Клеточная изоформа PrPC имеет молекулярную массу, варьирующую в зависимости от степени гликозилирования (ди-, моно- или негликозилированный), приблизительно 20-37 кДа, что лучше всего выявляется после разделения электрофорезом в 10-15% полиакриламидном геле. PrPres в инфицированных клетках сохраняет все формы гликозилирования PrPC, но вследствие удаления в процессе клеточной деградации примерно 96 аминокислотных остатков с N-концевого участка пептидной цепи электрофоретическая подвижность PrPres проявляет шифтовые различия.

С другой стороны, лабораторная диагностика ТГЭ у человека страдает отсутствием точных и относительно простых методов и средств верификации заболевания, что в свою очередь определяет отсутствие объективных данных по эпидемиологической ситуации по ТГЭ в стране.

Цель исследования - разработка диагностической тест-системы для выявления больных прионными инфекциями методом иммунного блоттинга.

В результате проведенных исследований разработан и апробирован экспериментальный образец тест-системы, предназначенной для обнаружения аномального протеазоустойчивого прионного белка PrP 27-30 в гомогенатах мозга людей с установленным (предполагаемым) клиническим и патологоанатомическим диагнозом губкообразной энцефалопатии методом иммунного блоттинга.

В основе анализа лежит процедура выявления протеазоустойчивой части PrPres с учетом трех основных характеристик: устойчивости к протеиназе К, размера молекулы, выявляемой при электрофорезе (27-30 кДа), и связывание со специфическим анти-PrP моноклональным антителом. Процедура постановки теста заключается в следующем: аутопсийный образец мозга (около 0,5 г) гомогенизируют, разрушают протеиназой К, не разрушенную часть денатурируют нагреванием, подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле, затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану, обрабатывают сначала первичными анти-PrP моноклональными антителами, затем вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена, и после нанесения субстратной смеси учитываются результаты. Длительность исследования - 7-8 ч. Тест-система рассчитана на проведение 45 анализов, включая контрольные. В ее комплектацию входит положительный контрольный образец, содержащий PrP 27-30, ряд концентрированных буферных растворов, некоторые основные реактивы и комплектующие, необходимые для проведения этапов гомогенизации и переваривания исследуемого образца, его денатурации при электрофоретическом разделении белков и переноса их на нитроцеллюлозную мембрану, обработки антителами (первичные и вторичные) и субстратной смеси для детекции PrP-иммунореактивных белков.

Диагностическая эффективность разработанной тест-системы оценивали при анализе аутопсийных образцов мозга людей с различными нейродегенеративными заболеваниями прионной природы (8 образцов) и неустановленной этиологии (44 образца). Протеазоустойчивый прионный белок PrP 27-30 был выявлен в блотах всех мозговых гомогенатах больных с клиническим и патоморфологическим диагнозом «болезнь Крейтцфельдта-Якоба» (3 спорадических случая) и «амиотрофический лейкоспонгиоз» (5 случаев). Показано его отсутствие при других нейродегенеративных заболеваниях с клиническим диагнозом «болезнь Альцгеймера», «дисциркуляторная энцефалопатия II-III степени», «мультисистемная атрофия», «боковой амиотрофический склероз», «множественный склероз» и др. Прионный белок PrP 27-30 не выявляли в гомогенатах мозга здоровых людей, погибших в результате нечастного случая.

На диагностическую «Тест-систему для выявления аномального протеазоустойчивого прионного белка PrP 27-30 в аутопсийных образцах мозга человека методом иммунного блоттинга «Прион-Блот» разработан Лабораторный регламент и Технические условия на производство. Тест-система проходит регистрацию в Министерстве здравоохранения в установленном порядке.