Амиотрофический лейкоспонгиоз (АЛ) - прогрессирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы человека из группы трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ). Характеризуется постепенным развитием вялых парезов конечностей с неуклонным нарастанием их выраженности, поражением и гибелью нейронов (преимущественно мотонейронов в спинном мозге), вакуолизацией аксонов и спонгиозом серого и белого вещества мозга. Выраженная прогредиентность всегда приводит к летальному исходу из-за расстройств дыхания исключительно спинального типа. Инфекционность при АЛ ассоциирована с накоплением патологического прионного белка PrPAL. Однако молекулярная природа инфекционного агента АЛ изучена еще недостаточно.

В основе патогенеза всех ТГЭ, как полагают, лежит процесс конверсии нормального клеточного белка приона (PrPC), имеющего преимущественно -спиральную структуру, в конформацию обогащенную -слоями с формированием при наличии идентичной первичной последовательности отличной от PrPC вторичной структуры прионного белка - PrPd (от англ. disease - болезнь). PrPd ассоциирован с накоплением инфекционности, и результаты недавних исследований in vitro подтверждают гипотезу, что сам PrPd является первичным компонентом инфекционного агента ТГЭ. Установлено, что из-за наличия гидрофобного кора из -слоев PrPd обладает частичной резистентностью к протеолизу и тенденцией к полимеризации в амилоидоподобные палочки или, так называемые, скрепи-ассоциированные фибриллы (САФ). При этом первичная аминокислотная последовательность самого PrP существенным образом влияет на процесс формирования прионных структур и их морфологию in vivo. Считается, что гетерогенность ТГЭ обусловлена в первую очередь 3-мерной структурой PrPd.

Таким образом, одной из важных проблем в области ТГЭ является понимание того, как различные звенья патогенеза инфекции могут быть объяснены в пределах контекста его основных структур PrPС и PrPd.

Цель исследования - изучить конформационный полиморфизм протеазоустойчивого белка приона амиотрофического лейкоспонгиоза (PrPAL) in vitro.

Микросомальные мембранные фракции, содержащие PrPAL, получали из аутопсийных образцов мозга людей, умерших с клиническим и лабораторно подтвержденным диагнозом АЛ. Готовили 10-кратные разведения мембранных фракций на 0,01 М трис-буферном растворе, pH 7,4 (от 10-1 до 10-10), отбирали аликвоты и подвергали обработке различными детергентами (0,5% дезоксихолат натрия (ДОХ), 0,5% нонидет Р-40 (NP-40), 2% додецилсульфат натрия (ДСН)) и протеазами (трипсин - 10-100 мкг/мл, протеиназа К - 10-100 мкг/мл) в разных комбинациях с длительностью экспозиции 5 и 30 мин, 1 и 2 ч, при температурах 22 °С (комнатная) и 37 °С и рН 7,4. Образцы исследовали в 4-кратной повторности.

Верификацию PrP-иммунореактивных белков осуществляли методом иммунного блоттинга. Анализ агрегатов PrPAL проводили на подложках из гидрофильного кремния с помощью атомного силового микроскопа Veeco (Nanoscope 3D) в прерывисто-контактном режиме сканирования (tapping mode) с использованием J-сканера. Амплитуда напряжения возбуждения колебаний кантиливера (driven amplitude) составляла 100 милливольт, резонансная частота кантиливера - 280 кГц. АСМ-изображения получали с частотой сканирования 1 и 2 Гц и разрешением 512Ч512 пикселей.

Исследования показали, что морфология агрегатов прионного белка при АЛ варьировала в зависимости от его концентрации в анализируемой пробе, используемой для гидролиза протеазы, и выбранного детергента.

До обработки детергентами и протеолитическими ферментами мембранные фракции содержали только аморфные глобулы и конгломераты белков, различающиеся по форме и размерам. Экстракция PrPAL каждым из используемых детергентов диспергировала мембранные глобулы в маленькие плеоморфные фрагменты, но по результатам иммунного блоттинга не вызывала изменения его молекулярной массы, которая составляла 33-35 кДа. Изучение топографии и профиля поверхности образцов, обработанных только 2% ДСН, показало, что в этих условиях на гидрофильной поверхности кремния PrPAL формирует сложную структуру с характерным выростом («чешуйчатая» конформация). Линейные размеры «чешуек» составляли около 150 нм в продольном и 120 нм в поперечном направлении. Высота агрегатов не превышала 2,5-3,0 нм. Структуры были повторяющимися и покрывали всю поверхность образца. При детергентной экстракции мембранных фракций ДОХ и NP-40 никаких регулярных структур, кроме глобулярных, не отмечено.

Ограниченный протеолиз только протеиназой К, как и в комбинации с детергентной экстракцией, конвертировал все молекулы PrPAL в PrP 27-30 кДа. Трипсин конвертировал PrPAL в PrP 31-34 кДа. Морфологически это проявлялось исчезновением в мембранных фракциях «чешуйчатых» агрегатов и формированием сложных агрегатов PrP 27-30 (PrP 31-34) с морфологией, напоминающей «шелковичную ягоду». Размеры «шелковицы» составляли 120-150 нм. Наблюдаемые конформации были образованы несколькими (от 4-6 и более) слегка вытянутыми белковыми агрегатами (олигомерами) с продольными размерами 51±8 нм (при обработке протеиназой К) и 65±6 нм (при обработке трипсином) и поперечными - 30±6 и 33±8 нм соответственно. Результаты исследования показали, что время, требуемое для сформирования агрегатов «шелковицы», зависело от времени, необходимого для гидролиза всех молекул PrPAL в PrP меньшего размера. Можно предположить, что эти агрегаты PrP являются инфекционными, поскольку ранее нами была показана трансмиссия АЛ очищенными фракциями PrPAL, полученными при аналогичной детергентной экстракции и ограниченном протеолизе, морским свинкам после интрацеребрального заражения.

В условиях эксперимента при детергентной экстракции и ограниченном протеолизе in vitro никаких прионных палочек обнаружено не было. В мембранных фракциях, содержащих низкие концентрации PrPAL (разведения 10-7 и 10-10), после последовательной обработки 2% ДСН (но не ДОХ и NP-40) и протеиназой К (100 мкг/мл) были обнаружены тонкие филаментозные структуры длиной до 1 мкм. Причем выявлялись два типа нитевидных агрегатов: первый - диаметром 12±1 нм и высотой около 1,2 нм, второй - диаметром 18±2 нм и высотой приблизительно 1,8 нм. Самосборка PrP 27-30 с образованием прионных фибрилл отмечена только в растворах с низким содержанием белка и в условиях длительной ферментативной обработки ( 2 ч, 37 °С).

Следует отметить, что для формирования специфических прионных агрегатов при АЛ («шелковицы» и тонкие филаментозные структуры) требуется каталитически активная протеаза. Образование PrP 27-30 из PrPAL при гидролизе протеиназой К до добавления ингибитора протеазы (1 мМ фенилметилсульфонил флюорид - PMSF) является, по-видимому, недостаточным, чтобы вызвать сборку прионных олигомеров в регулярную структурированную конформацию.

Таким образом, в настоящей работе впервые с использованием атомно-силовой микроскопии представлены доказательства того, что патологический прионный белок (PrPAL), выявляемый в мозге людей, умерших от амиотрофического лейкоспонгиоза, формирует различные строго специфические структуры in vitro, форма и размеры которых коррелируют в зависимости от условий эксперимента. Проведенные исследования предполагают, что оригинальные свойства, присущие самому прионному белку АЛ, определяют его конформацию в экстрактах зараженных тканей. Гидролиз PrPAL является необходимым этапом при формировании прионных агрегатов, так как в экстрактах тканей, содержащих негидролизованный PrPAL, нет никаких специфических для прионов палочек или других распознаваемых амилоидоподобных полимеров. При высокой концентрации прионного белка (разведение 10-1-10-3) процесс агрегации происходит достаточно быстро, и образующиеся из PrP 27-30 мелкие олигомеры латерально собираются по 4-6 (до 8-10) в структуры типа «шелковичная ягода». При низкой концентрации белка (10-7-10-10), когда эффективность полимеризации, по-видимому, замедляется, мономеры PrP 27-30 формируют исключительно удлиненные фибриллы, скорость образования которых увеличивается с повышением температуры и длительности обработки. АСМ-анализ образцов показал, что прионные фибриллы, образующиеся при низкой концентрации белка, являются более длинными, чем таковые, образованные при более высокой белковой концентрации.