В последние годы для направленной терапии онкологических заболеваний все более активно применяются моноклональные антитела и их производные, в частности рекомбинантные иммунотоксины - химерные молекулы на основе фрагментов антител и цитотоксических белков. Одними из наиболее перспективных иммунотоксинов, конструируемых для элиминации клеток рака молочной железы (РМЖ), являются химерные белки, содержащие фрагменты терапевтического антитела 4D5 (герцептина, или трастузумаба), направленного к онкогену-маркеру с-ErbB2 (HER-2/neu, p185HER2). Данный маркер, представляющий собой внеклеточный сегмент рецепторного комплекса неустановленной лигандной специфичности, гиперэкспрессирован на клеточной мембране значительной группы опухолей (рак молочной железы, карцинома яичника, легких и др.), что коррелирует с агрессивностью течения заболевания, резистентностью опухоли к химиотерапии и плохим прогнозом. Присоединение к фрагменту антитела 4D5 дополнительного токсического модуля в виде РНКазы предпринято в попытке повысить цитотоксическую эффективность терапевтического белка.

Объектом исследования является рекомбинантный иммунотоксин scFv4D5-барназа, созданный на основе антигенсвязывающего scFv фрагмента герцептина (антитела 4D5) и РНКазы из бактерии Bacillus amyloliquefaciens.

Сущность достижения и его новизна заключаются в получении стабилизированного раствора рекомбинантного иммунотоксина scFv4D5-барназа, подборе инъекционной среды для его внутривенного введения, а также разработке метода лиофилизации, обеспечивающего сохранение способности к перерастворению без существенного изменения конформации белка.

Изучение стабильности физических свойств раствора иммунотоксина scFv4D5-барназа. Стабильность инъекционных растворов белков и других лекарственных средств является одним из пермиссивных условий их применения. Она достигается строгим подбором асептических условий их приготовления, оптимальных температурных режимов, стерилизацией и/или применением допустимых антимикробных средств, а также использованием стабилизаторов - веществ, повышающих устойчивость растворимых форм лекарственных веществ к агрегации как основному фактору старения растворов. На сегодняшний день большинство применяемых инъекционных растворов содержат добавки стабилизаторов различной химической структуры. Состав стабилизирующей среды необходимо разрабатывать для каждого индивидуального белка, так как прогноз на основе принятых на сегодня теорий вклада гидрофобных и ионных взаимодействий в структуру белков носит весьма приблизительный характер.

В основу метода определения стабильности рекомбинантного иммунотоксина scFv4D5-барназа положен подход, предложенный Д. Бремсом (1988) для анализа растворимости бычьего гормона роста. Производят измерение оптической плотности раствора белка при 450 нм для оценки светорассеяния, вызванного формированием растворимых ассоциатов белка как первой стадии агрегации. В спектральной области 450 нм абсорбция света ароматическими хромофорами белка отсутствует, и все оптическое поглощение раствора обусловлено опалесценцией, т. е. светорассеянием надмолекулярных комплексов белка.

Для поиска составов, стабилизирующих рекомбинантный белок, концентрированный раствор иммунотоксина разводили различными буферными средами и регистрировали спектры поглощения полученных растворов на спектрофотометре Specord 250 (Analytik Jena, Германия) при 450 нм. Иммунотоксин получали методом металл-хелатной хроматографии в мочевине (Марцев, 2008) и подвергали рефолдингу из развернутого денатурантом состояния в компактную конформацию в гистидиновом буфере, позволявшем концентрирование белка до 5-7 мг/мл с использованием системы Centricon («Millipore», США). Белок разбавляли в 6-8 раз следующими буферами:

25 мМ гистидин с различным рН - рН 3,4; 4,0; 6,0

50 мМ цитрат натрия с различным рН - рН 4,1; 4,95; 6,1

50 мМ НФБ, рН 7,4

50 мМ Трис-солянокислый, рН 8,1

50 мМ натрий-борат, рН 8,5

Образцы инкубировали в течение 16-18 ч при температуре 37 °С и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм.

В эксперименте показано, что при разбавлении иммунотоксина всеми использованными буферами, за исключением гистидинового, наблюдалось быстрое формирование светорассеивающих ассоциатов с последующей преципитацией белка. Таким образом, из всех рассмотренных растворов только гистидин способен стабилизировать химерный белок scFv4D5-барназу. Стабилизирующее действие гистидина позволяет как концентрировать иммунотоксин до концентраций 5-7 мг/мл, недостижимых в средах другого состава, так и получать относительно разбавленные растворы (0,2-1,0 мг/мл), близкие к ожидаемым инъекционным концентрациям. Однако гистидин как однокомпонентный раствор не применяется для внутривенных инъекций, поэтому мы продолжили поиск сред, соответствующих условиям внутривенного введения и способных стабилизировать растворимую форму иммунотоксина.

Стабильность препарата иммунотоксина в инфузионных растворах. Растворимость иммунотоксина scFv4D5-барназа анализировали в 0,9%-м (изотоническом) растворе хлорида натрия как среде, наиболее часто используемой для внутривенного введения лекарственных препаратов. Для этого концентрированный иммунотоксин разбавляли 0,9%-м раствором NaCl до конечной концентрации 0,8-1 мг/мл и регистрировали оптическую плотность при фиксированной длине волны 450 нм в непрерывном режиме в течение 30 мин.

Результаты, представленные на рис. 1а, свидетельствуют о том, что быстрая смена ионного состава среды вызывает интенсивную опалесценцию в результате агрегации белка. Таким образом, изотонический раствор хлорида натрия является скорее дестабилизирующей средой для исследуемого препарата иммунотоксина. Добавление в среду разведения (0,9%-м NaCl) гистидина в концентрациях 0-250 мМ приводит к уменьшению уровня агрегации вплоть до полного ее отсутствия при концентрации гистидина 250 мМ. Следует заметить, что концентрация гистидина 250 мМ многократно превышает допустимую для системных инъекций. Гистидин входит в состав аминокислотных смесей для внутривенного введения, однако в значительно меньшей парциальной концентрации - около 20 мМ. В такой концентрации гистидин в наших условиях не обеспечивает достаточную стабилизацию иммунотоксина, необходимую для внутривенного введения.

В качестве потенциальных стабилизаторов иммунотоксина исследовались также другие соединения, разрешенные для системных инъекций: сахара (декстран, сахароза, трегалоза), неионные детергенты (Tween-20) и их комбинации. Результаты представлены на рис. 1б.

Рис. 1. Временная зависимость светорассеивания раствора иммунотоксина при разбавлении 0,9%-м раствором NaCl с различными концентрациями гистидина (а)
Рис. 2. Анализ стабильности третичной структуры scFv4D5-барназы методом сканирующей калориметрии. Приведены «кривые плавления» белка в фосфат-хлоридном буфере до (сплошная линия) и после (пунктир) лиофилизации. Пики тепловых переходов соответствуют кооперативному разрушению («плавлению») третичной структуры барназного модуля (52-53 °С) и c-ErbB2-связывающего scFv фрагмента (65-66 °С)

Сами по себе сахара оказывали лишь весьма слабый стабилизирующий эффект. Максимальный уровень стабилизации иммунотоксина (не исключающий, тем не менее, агрегации части белка) наблюдался в случае применения 1% Tween-20 и комбинации 1% Tween-20 + 200 мМ трегалозы. Отметим, что используемая концентрация Tween-20 (1%) примерно в 100 раз превышает применяемую для системных инъекций и не может быть использована для стабилизации инъекционной формы иммунотоксина.

Принципиально иной результат получен при разведении концентрированного в гистидиновом буфере иммунотоксина 5%-м раствором декстрозы (глюкозы) для инфузий. Применение данной инъекционной среды не вызывало преципитации иммунотоксина в получасовой шкале времени при комнатной температуре. В условиях «ускоренного старения» при температуре 37 °С рекомбинантный белок не показывал признаков опалесценции после его инкубации в 5%-м растворе глюкозы в течение суток, что соответствует не менее чем недельному сроку инкубации при +4 °С. Эти данные свидетельствуют об эффективности 5%-го раствора глюкозы в качестве стабилизатора растворимой формы иммунотоксина.

Получение лиофилизованной формы иммунотоксина scFv4D5-барназа. Лиофилизация является наиболее удобным и надежным (хотя не всегда достижимым) способом стабилизации исходного препарата терапевтических белков, поскольку создает возможность хранения лекарственных форм в течение длительного времени. Практическое использование лиофилизованных форм белков требует, однако, устранения ряда негативных факторов. Сюда относится в первую очередь образование нерастворимых белковых агрегатов в ходе лиофильной сушки, а также возможная инактивация белков. В связи с этим ключевое значение имеет правильный подбор состава раствора, из которого производится лиофилизация белка. С этой целью нами проведен скрининг нескольких буферных систем для лиофилизации, из которых оптимальным по параметру сохранения растворимости после лиофилизации обладал буфер PBS (0,15 М NaCl, 0,01 М натрий-фосфат, рН 7,5).

Доказательство сохранения конформации и термодинамической стабильности белка после лиофилизации получено высокоразрешающим методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяющим наиболее корректно и количественно оценить вклад структурных взаимодействий в третичную конформацию белка. Кроме того, ранее мы показали (Марцев, 2008), что сканирующая калориметрия позволяет отдельно оценить структурные параметры обоих модулей иммунотоксина - узнающего (scFv фрагмента) и РНКазного. По данным калориметрии, лиофилизация иммунотоксина, растворенного в PBS, не оказывала заметного влияния на структурные свойства белка. В частности, зависимость теплоемкости scFv4D5-барназы до и после лиофилизации от температуры носила бимодальный характер с максимумами теплопоглощения при 53 и 66 °С до лиофилизации (РНКазный и scFv модули иммунотоксина соответственно) и 52,6 и 65,2 °С после лиофилизации (рис. 2). Интегральная калориметрическая энтальпия ( h) термоденатурации химерного белка до и после лиофилизации составляла 21,0 и 20,8 Дж/г соответственно. Полученные близкие величины энтальпии температурных переходов, характерные для белков со сформированной и стабильной третичной структурой, доказывают отсутствие изменений третичной структуры белка в результате лиофилизации и свидетельствуют о правильно подобранных параметрах процесса, что позволяет длительно хранить иммунотоксин без ухудшения его свойств. Лучшее разрешение пиков теплопоглощения у белка после лиофилизации связано в первую очередь с увеличением кооперативности термоденатурации РНКазного модуля, что регистрируется по сужению низкотемпературного пика. Одновременно снижается кооперативность перехода узнающего модуля (scFv фрагмента), что регистрируется по расширению высокотемпературного пика. Эти данные наряду с очевидной тенденцией высокотемпературного перехода к разделению на два термоденатурационных процесса в двухдоменном модуле scFv являются индикаторами структурных перестроек молекулы иммунотоксина, выяснение природы которых требует дополнительных исследований.

Таким образом, в данной работе нами найдены составы среды для стабилизации растворимой формы иммунотоксина scFv4D5-барназа: 20 мМ гистидин, рН 5,7 для получения и хранения концентрированного белка и 5%-й раствор декстрозы в качестве стабилизатора иммунотоксина в низких концентрациях, отвечающих целям создания инъекционной формы иммунотоксина. Кроме того, подобрана буферная система и условия получения лиофилизованной формы рекомбинантного белка.