Достижения последних лет в области диагностики и лечения онкогематологических заболеваний стали возможны только благодаря открытию новых молекулярных механизмов возникновения и прогрессии онкогематологических заболеваний. Это позволило, в частности, значительно точнее диагностировать минимальную резидуальную болезнь (МРБ) - очень важный фактор, влияющий на успех лечения и прогноз болезни в целом. Как показано, большое значение в персистировании МРБ имеют патологические изменения в клетке, связанные с метилированием ДНК. Например, экспрессия гена множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (multidrug resistance gene - MDR1) часто связана с неблагоприятным прогнозом и в свою очередь коррелирует с аномальным гипометилированием гена MDR1. Можно считать установленным фактом, что генез и прогрессирование онкогематологической патологии детерминируют не только классические генетические изменения (мутации), но и изменения, связанные с нарушением метилирования цитозина (единственного азотистого основания, метилируемого у человека) в геноме. Чаще всего такие изменения затрагивают регуляторно-промоторные области генов. Так, установлено, что в большинстве случаев в процессе формирования лекарственной устойчивости идет повышение экспрессии MDR-1 и, соответственно, кодируемого им гликопротеина P. Это сопровождается значительным снижением уровня метилирования CpG-сайтов в регуляторно-промоторной области гена MDR-1. В процессе лечения лейкозов происходит отбор лейкемических клонов, устойчивых к противолейкемическим препаратам. Важнейшим фактором развития такой устойчивости является повышенная транскрипционная активность MDR1, кодирующего мембранный белок - P-гликопротеин (pgp-170).

Y-бокс-связывающий белок (YB-1) является многофункциональным ДНК/РНК-связывающим белком, участвующим в воспроизведении, сохранении и экспрессии генетической информации. Белок обладает высоким сродством к мРНК и сопровождает ее на всем пути от синтеза до распада. Показано, что экспрессия YB-1 имеет тесную взаимосвязь с MDR1/pgp-170-экспрессией при ряде злокачественных новообразований: рак молочной железы, яичников и др. В то же время исследования такого взаимодействия при онкогематологической патологии не проводились. В данной работе исследован характер метилирования регуляторно-промоторной области гена MDR1, иммунофенотипической экспрессии белка pgp-170 в сопоставлении с экспрессией YB-1-гена у больных с различными видами неоплазий костного мозга и у здоровых доноров.

Использовались методы краткосрочных культур клеток, иммунофенотипирования, метилзависимая полимеразных цепей реакция (МЗ-ПЦР), обратнотранскриптазная полимеразных цепей реакция (ОТ-ПЦР), электрофорез ДНК в агарозе, сканирование геля.

В качестве исходного материала для выделения ДНК были использованы лейкоциты периферической крови и ядросодержащие клетки костного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) различных стадий заболевания. Всего было исследовано 44 образца ДНК лиц с неоплазиями костного мозга, в т. ч. 15 образцов - острый миелобластный лейкоз (ОМЛ); 6 образцов - острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); 3 образца - хронический миелолейкоз (ХМЛ); 10 образцов - хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). В качестве контроля использовались образцы ДНК периферической крови 10 здоровых доноров. Во всех случаях диагноз подтверждался морфологическими, цитохимическими методами и методом иммунофенотипирования. Для анализа экспрессии белка pgp-170 использовались антитела фирмы Becton-Dickinson (США). В качестве материала для выделения ДНК использовались как цельные, так и фракционированные (с использованием фикол-верографинового градиента с плотностью 1,077) препараты крови и костного мозга. Около 250-500 нг ДНК инкубировали с 20-25 ЕД рестрикционной эндонуклеазы HpaII (чувствительной к метилированию ДНК) или MspI (не чувствительной к метилированию ДНК) в течение 16-18 ч при 37 °C. Полученные образцы использовали в ПЦР.

Праймеры для МЗ-ПЦР

В реакции использовались праймеры (производитель - ОДО «Праймтех», РБ) к МD1, МD2 и MDC-фрагментам 5’-промоторной области MDR-1 гена с целью выполнения метилчувствительной полимеразных цепей реакции. Это 5’-праймеры к MD1-области: MD1/5 5’-TCT AgA gAg gTg CAA Cgg AAg-3’; MD1/3 5’-TCA gCC TCA CCA CAg ATg AC-3’ (120 пар нуклеотидов, пн); и к MD2-области 5’-промоторной области MDR-1 гена: MD2/5 5’-TgA AgT CCT CTg gCA AgT CC-3; MD2/3 5’-ATT CTC CCT CCC ggT TCC-3’ (210 пн). В качестве контроля синтезированы праймеры к участку промоторной области MDR-1 гена, не содержащей CpG-последовательностей и, следовательно, не подверженной гидролизу HpaII/MspI рестрикционными эндонуклеазами: MDC5 5’-ATT TCA CgT CTT ggT ggC C-3’ и MDC3 5’-TCC AgT gCC ACT ACg gTT Tg-3’ (240 пн).

Параметры МЗ-ПЦР. Для анализа состояния метилирования 5’-промоторной области MDR-1 гена в реакции (общий объем реакции - 5 мкл) использовали праймеры в концентрации 1 мкмоль/л. МЗ-ПЦР выполняли в течение 30 циклов: 1-й цикл: 95 °С - 3 мин, 57 °С - 1 мин, и 72 °С 2 мин. Циклы 2-30: 95 °С - 30 с, 60 °С - 30 с, 72 °С - 10 мин. 8-10 мкл реакционной смеси вносили в лунку с 2%-м агарозным гелем. Затем гель окрашивали этидиум-бромидом, фотографировали и сканировали в гель-документирующем устройстве. Образцы исследовали трижды. Результат оценивали как положительный (деметилирование), если в 2 из 3-х образцов детектировались продукты реакции.

Обратно-транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР)

Для изучения характера экспрессии гена YD-1 РНК выделяли из ядросодержащих клеток (лейкоцитов) здоровых доноров (контрольные образцы), а также из ядросодержащих клеток периферической крови и костного мозга больных гемобластозами (см. выше).

Одноцепочечную кДНК синтезировали из примерно 1 мкг ДНК с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии Молони (Moloney), рандом-праймера и ингибитора РНК. Последующую ПЦР выполняли в объеме 10 мкл, содержащем эквивалентное 100 нг РНК количество кДНК, 1 мкмоль/л каждого из праймеров гена MDR1 и 2-микроглобулина в качестве контроля. Реакцию для каждого гена выполняли отдельно.

Были использованы следующие праймеры:

YB-1/1 5’-CAATGTAAGGAACGGATATGG-3’;

YB-1/2 5’-TTCCCCACTCTCACTATTCTG-3’;

2-микроглобулин 5’-GTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGC-3’;

5’-TTCACTCAATCCAAATGCGGCATCTTC-3’

Результаты ОТ-ПЦР YB-1 затем сопоставляли с данными метилирования 5’-области MDR1/.

Часть экспериментального этапа работы выполнена в лаборатории генной инженерии филиала Института биоорганической химии Российской академии наук.

Результаты исследований свидетельствуют о наличии корреляции между экспрессией YB-1 гена и статусом метилирования MDR-1 гена у больных, находящихся в стадии прогрессирования заболевания; высокие показатели транскрипционной активности YB-1-гена в большинстве случаев соответствуют низкому уровню метилирования CpG-последовательностей регуляторно-промоторной области MDR1.

Нижеприведенная таблица демонстрирует количество случаев деметилирования регуляторно-промоторной области гена MDR1-гена и экспрессии YB-1 с клинической картиной заболевания.

Таблица

* в скобках указано число наблюдений; ** классификация ХЛЛ по Rai; рем. - ремиссия; рец. - рецидив острой лейкемии; хрон. - хроническая фаза ХМЛ; аксел. - фаза акселерации; БК - бластный криз.

При острых лейкозах и хроническом миелоидном лейкозе уровень экспрессии белка pgp колебался от 0,03 до 40%, увеличиваясь по мере прогрессии заболевания. Как видно из табл., ассоциативная связь YB-1/MDR1(pgp) чаще наблюдается при прогрессии болезни, нежели в начальных стадиях, и более характерна для лейкозов миелоидного ряда. Эти данные согласуются с ранее выполненными исследованиями, где показано, что при большинстве лейкемий миелоидного ряда существует обратная корреляция между уровнем метилирования MDR-1-гена и экспрессией pgp-фенотипа, и, соответственно, степенью прогрессии заболевания. Таким образом, деметилирование 5’-промоторной области гена MDR-1 часто коррелирует с экспрессией самого гена и селекцией резистентного клона лейкозных клеток.

При лейкозах лимфоидного происхождения ассоциация YB-1/MDR1(pgp) не столь характерна, но и при этой патологии количество случаев положительной корреляции YB-1/MDR1(pgp) с клинико-лабораторной картиной возрастает по мере прогрессии заболевания. Особенно характерно деметилирование и нарастание экспрессии YB-1-мРНК по мере прогрессии ХМЛ, хотя малая величина выборки при этой нозологии не позволяет сделать однозначный вывод. Полученные данные, вероятно, свидетельствуют о том, что приобретение фенотипа множественной лекарственной устойчивости ассоциируется не только с MDR1, но и с YB-1-экспрессией, причем подобная ассоциация более характерна для больных лейкемиями миелоидного ряда и на поздних стадиях заболевания.

В исследовании проанализирован характер корреляции метилирования 5’-промоторной области гена MDR-1 в норме и при лейкозах и экспрессией нового маркера- гена YB-1. Как известно, ген MDR-1 имеет прямое отношение к ответу на химиотерапию онкогематологических заболеваний, а деметилирование ДНК в его регуляторно-промоторной области, как правило, коррелирует с экспрессией гена. Фактором, потенцирующим транскрипционную активность MDR1 в ядре клетки, является Y-бокс-белок. Дальнейшие исследования на большой когорте пациентов должны выяснить, является ли ассоциативная связь между YB-1 и pgp-170 в различных аспектах (метилирование гена MDR1 и YB-1; их РНК и фенотипическая экспрессия) клинически значимым маркером в развитии множественной лекарственной устойчивости. Если такая связь действительно является устойчивой, то феномен YB-1/MDR1-ассоциации станет еще одним шагом на пути создания эпигенетической панели маркеров прогрессирования лейкемической болезни, детекции минимальной остаточной болезни и рационализации терапии онкогематологических заболеваний. Перспективно также использование такого подхода для оценки контаминации трансплантата гемопоэтических стволовых кроветворных клеток.