![]() |
УДК: 615.28:615.33
Год издания: 2010
Значение металло-бета-лактамаз в формировании и распространении устойчивости Pseudomonas aeruginosa к карбапенемам
Тапальский Д.В., Осипов В.А., Склеенова Е.Ю., Романов А.В., Эйдельштейн М.В.
Рубрики: 76.03.43, 76.33.43
Гомельский государственный медицинский университет
Тема НИР: «Значение металло-бета-лактамаз различных генетических групп в формировании и распространении устойчивости Pseudomonas aeruginosa к карбапенемам»
Сроки выполнения НИР: 01.04.2008 г. — 31.03.2010 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук, доц. Д.В. Тапальский
Соисполнители: НИИ антимикробной химиотерапии, г. Смоленск, Россия
Источник финансирования: госбюджет
Цель исследования - определение распространения металло-бета-лактамаз различных генетических групп среди госпитальных штаммов P.aeruginosa и разработка системы мероприятий по сдерживанию нарастания устойчивости синегнойной палочки к карбапенемам.
Собрана коллекция из 107 полиантибиотикорезистентных карбапенемрезистентных клинических изолятов P.aeruginosa, выделенных из клинического материала госпитализированных больных в 2007-2009 гг. в 16 стационарах 4-х областных центров Беларуси и г. Минска. Выполнена реидентификация штаммов и определена чувствительность к 15 антибактериальным препаратам методом пограничных концентраций с использованием автоматического бактериологического анализатора ATB Expression (bioMerieux, Франция). Для всех карбапенемрезистентных штаммов выполнен фенотипический скрининг продукции металло-бета-лактамаз (МБЛ) методом двойных дисков с ЭДТА. Для обнаружения генов МБЛ VIM и IMP типов использована мультиплексная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Шевчеко О. и соавт., 2007). Для тестирования отобраны 19 МБЛ-позитивных изолятов и 11 карбапенемрезистентных изолятов P.aeruginosa, для которых фенотипический скрининговый тест с ЭДТА выявил отрицательный или сомнительный результат. Идентификация амплификационных фрагментов blaVIM и blaIMP генов проводилась путем определения температур их плавления (~80°C для blaIMP и ~85°C для blaVIM) в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I. Дополнительно сравнивались кривые плавления опытных образцов с кривыми плавления позитивных контрольных штаммов.
Для оценки структуры интегронов, несущих гены МБЛ, использован метод ПЦР-рестрикционного картирования (Shevchenko O. et al., 2008). Вариабельные участки интегронов I класса амплифицированы с помощью праймеров к 5’ (intI1) и 3’ (qacE 1 или tniC/Tn5090) консервативным последовательностям интегронов в парах с внутренними праймерами к генам blaVIM и подвергнуты рестрикции эндонуклеазой TaqI. Полученные рестрикционные профили ПЦР фрагментов сопоставлены с соответствующими профилями известных МБЛ-кодирующих интегронов, использованных в качестве контролей.
Выполнено эпидемиологическое маркирование карбапенемрезистентных изолятов P.aeruginosa с использованием мультилокусного анализа тандемных повторов (multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA) согласно схеме L. Onteniente et al. Проведена оценка количества тандемных повторов в шести VNTR-локусах (VNTR - Variable Number Tandem Repeat, тандемные повторы с переменным числом звеньев). Амплификация шести VNTR-локусов выполнена с помощью мультиплексной ПЦР (по 2 отдельные реакции для каждого изолята). Анализ размеров продуктов амплификации шести VNTS-локусов выполнен методом капиллярного электрофореза с флуоресцентной детекцией (фрагментный анализ) на автоматическом секвенаторе ABI-310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Кластерный анализ MLVA профилей проведен с помощью программного пакета Bionumerics v.6.01 (Applied Maths) с использованием категориальных значений длин VNTR локусов и алгоритма построения дендрограмм минимальных дистанций (Minimum Spanning Tree).
Для всех штаммов подтверждена устойчивость к карбапенемам, сочетающаяся с устойчивостью к большинству исследованных антибактериальных препаратов, за исключением колистина.
С помощью метода «двойных дисков с ЭДТА» продукция МБЛ выявлена у 19 из 107 карбапенемрезистентных штаммов P.aeruginosa из 6 лечебных учреждений 3 городов. Проанализирована ассоциированная устойчивость МБЛ-продуцирующих карбапенемрезистентных штаммов. Все они имели общий фенотип резистентности (устойчивость к тикарциллину, тикарциллин/клавуланату, пиперациллину, пиперациллин-тазобактаму, цефтазидиму, цефепиму, имипенему, меропенему, амикацину, гентамицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, котримоксазолу; чувствительность к колистину).
У всех 19 изолятов по данным ПЦР-анализа подтверждено наличие МБЛ VIM-типа. Методом ПЦР-рестрикционного картирования установлена идентичность структуры интегронов, несущих ген МБЛ, у данных изолятов и VIM-2-кодирующего интегрона с набором генетических кассет: aacA7-blaVIM-2-dhfrB5-aacC-A5 (GenBank Acc. No. DQ52233), ранее описанного у штаммов P.aeruginosa из США (Lolans K. et al., 2005), России (Shevchenko O. et al., 2008). и Норвегии (Samuelsen O. et al., 2010).
По результатам MLVA-типирования показана принадлежность 18 из 19 МБЛ-позитивных штаммов к единому клональному комплексу, о чем свидетельствует соответствие количества тандемных повторов по 5-6 анализируемым VNTR-локусам (таблица). Отдельного внимания заслуживает штамм № 2950 (г. Могилев), имеющий отличия по четырем VNTR-локусам (ms061, ms127, ms142 и ms010) от преобладающего MLVA-паттерна. Представленный изолят не являлся частью единого клонального комплекса, в который входили все другие выделенные на территории Беларуси МБЛ-продуцирующие штаммы P.aeruginosa.
В результате исследования обнаружено 19 МБЛ-продуцирующих изолятов, выделенных в шести лечебных учреждениях трех регионов республики и определено наличие у них blaVIM-генов. Показано преимущественно клональное распространение МБЛ-продуцирующих штаммов синегнойной палочки на территории республики. Вместе с тем, совпадение структуры МБЛ-кодирующего интегрона у всех изолятов, включая генетически отличный штамм, указывает на возможность как вертикального, так и горизонтального распространения МБЛ среди клинических штаммов. Для ограничения циркуляции МБЛ-продуцирующих изолятов P.aeruginosa в лечебных учреждениях необходимо создание системы микробиологического мониторинга, направленного на выявление колонизированных пациентов. Для своевременного выявления эпидемически значимых клонов и разработки мероприятий инфекционного контроля по ограничению их циркуляции необходимо проведение многоцентровых исследований, включающих определение механизмов карбапенемрезистентности и эпидемиологическое маркирование карбапенемрезистентных изолятов.
Не обнаружено карбапенемрезистентных изолятов (в т. ч. МБЛ-продуцирующих), устойчивых к колистину, что позволяет рекомендовать данный препарат для терапии инфекций, вызванных госпитальными панрезистентными штаммами P.aeruginosa.
Область применения: клиническая микробиология, эпидемиология
Рекомендации по использованию: результаты исследования могут быть внедрены в микробиологических лабораторияхцентров гигиены и эпидемиологии РБ
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении фенотипических методов детекции металло-бета-лактамаз в микробиологических лабораториях, организация и проведение обучающих семинаров, совместных исследований по изучению механизмов резистентности и определению эпидемиологических маркеров штаммов — продуцентов металло-бета-лактамаз