Цель исследования - определение распространения металло-бета-лактамаз различных генетических групп среди госпитальных штаммов P.aeruginosa и разработка систе­мы мероприятий по сдерживанию нарастания устойчиво­сти синегнойной палочки к карбапенемам.

Собрана коллекция из 107 полиантибиотикорези­стентных карбапенемрезистентных клинических изоля­тов P.aeruginosa, выделенных из клинического матери­ала госпитализированных больных в 2007-2009 гг. в 16 стационарах 4-х областных центров Беларуси и г. Мин­ска. Выполнена реидентификация штаммов и определе­на чувствительность к 15 антибактериальным препара­там методом пограничных концентраций с использова­нием автоматического бактериологического анализато­ра ATB Expression (bioMerieux, Франция). Для всех кар­бапенемрезистентных штаммов выполнен фенотипиче­ский скрининг продукции металло-бета-лактамаз (МБЛ) ме­тодом двойных дисков с ЭДТА. Для обнаружения генов МБЛ VIM и IMP типов использована мультиплексная по­лимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Шевчеко О. и соавт., 2007). Для тестирования отобраны 19 МБЛ-позитивных изолятов и 11 карбапенемрезистент­ных изолятов P.aeruginosa, для которых фенотипический скрининговый тест с ЭДТА выявил отрицательный или сомнительный результат. Идентификация амплификаци­онных фрагментов blaVIM и blaIMP генов проводилась путем определения температур их плавления (~80°C для blaIMP и ~85°C для blaVIM) в присутствии интеркалирующего флу­оресцентного красителя SYBR Green I. Дополнительно сравнивались кривые плавления опытных образцов с кри­выми плавления позитивных контрольных штаммов.

Для оценки структуры интегронов, несущих гены МБЛ, использован метод ПЦР-рестрикционного картиро­вания (Shevchenko O. et al., 2008). Вариабельные участки интегронов I класса амплифицированы с помощью прай­меров к 5’ (intI1) и 3’ (qacE 1 или tniC/Tn5090) консерва­тивным последовательностям интегронов в парах с вну­тренними праймерами к генам blaVIM и подвергнуты ре­стрикции эндонуклеазой TaqI. Полученные рестрикцион­ные профили ПЦР фрагментов сопоставлены с соответ­ствующими профилями известных МБЛ-кодирующих ин­тегронов, использованных в качестве контролей.

Выполнено эпидемиологическое маркирование кар­бапенемрезистентных изолятов P.aeruginosa с исполь­зованием мультилокусного анализа тандемных повто­ров (multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA) согласно схеме L. Onteniente et al. Проведена оценка количества тандемных повторов в шести VNTR-локусах (VNTR - Variable Number Tandem Repeat, тан­демные повторы с переменным числом звеньев). Ампли­фикация шести VNTR-локусов выполнена с помощью мультиплексной ПЦР (по 2 отдельные реакции для каж­дого изолята). Анализ размеров продуктов амплифика­ции шести VNTS-локусов выполнен методом капилляр­ного электрофореза с флуоресцентной детекцией (фраг­ментный анализ) на автоматическом секвенаторе ABI-310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Кластерный анализ MLVA профилей проведен с помощью программного па­кета Bionumerics v.6.01 (Applied Maths) с использовани­ем категориальных значений длин VNTR локусов и алго­ритма построения дендрограмм минимальных дистанций (Minimum Spanning Tree).

Для всех штаммов подтверждена устойчивость к кар­бапенемам, сочетающаяся с устойчивостью к большин­ству исследованных антибактериальных препаратов, за исключением колистина.

С помощью метода «двойных дисков с ЭДТА» про­дукция МБЛ выявлена у 19 из 107 карбапенемрезистент­ных штаммов P.aeruginosa из 6 лечебных учреждений 3 городов. Проанализирована ассоциированная устойчи­вость МБЛ-продуцирующих карбапенемрезистентных штаммов. Все они имели общий фенотип резистентности (устойчивость к тикарциллину, тикарциллин/клавуланату, пиперациллину, пиперациллин-тазобактаму, цефтазиди­му, цефепиму, имипенему, меропенему, амикацину, гента­мицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, котримоксазолу; чувствительность к колистину).

У всех 19 изолятов по данным ПЦР-анализа под­тверждено наличие МБЛ VIM-типа. Методом ПЦР-рестрикционного картирования установлена идентич­ность структуры интегронов, несущих ген МБЛ, у дан­ных изолятов и VIM-2-кодирующего интегрона с набо­ром генетических кассет: aacA7-blaVIM-2-dhfrB5-aacC-A5 (GenBank Acc. No. DQ52233), ранее описанного у штам­мов P.aeruginosa из США (Lolans K. et al., 2005), России (Shevchenko O. et al., 2008). и Норвегии (Samuelsen O. et al., 2010).

По результатам MLVA-типирования показана принад­лежность 18 из 19 МБЛ-позитивных штаммов к единому клональному комплексу, о чем свидетельствует соответ­ствие количества тандемных повторов по 5-6 анализиру­емым VNTR-локусам (таблица). Отдельного внимания за­служивает штамм № 2950 (г. Могилев), имеющий отли­чия по четырем VNTR-локусам (ms061, ms127, ms142 и ms010) от преобладающего MLVA-паттерна. Представ­ленный изолят не являлся частью единого клонально­го комплекса, в который входили все другие выделенные на территории Беларуси МБЛ-продуцирующие штаммы P.aeruginosa.

В результате исследования обнаружено 19 МБЛ-продуцирующих изолятов, выделенных в шести лечеб­ных учреждениях трех регионов республики и определе­но наличие у них blaVIM-генов. Показано преимуществен­но клональное распространение МБЛ-продуцирующих штаммов синегнойной палочки на территории респу­блики. Вместе с тем, совпадение структуры МБЛ-кодирующего интегрона у всех изолятов, включая гене­тически отличный штамм, указывает на возможность как вертикального, так и горизонтального распространения МБЛ среди клинических штаммов. Для ограничения цир­куляции МБЛ-продуцирующих изолятов P.aeruginosa в лечебных учреждениях необходимо создание системы ми­кробиологического мониторинга, направленного на выяв­ление колонизированных пациентов. Для своевременно­го выявления эпидемически значимых клонов и разработ­ки мероприятий инфекционного контроля по ограниче­нию их циркуляции необходимо проведение многоцентро­вых исследований, включающих определение механизмов карбапенемрезистентности и эпидемиологическое марки­рование карбапенемрезистентных изолятов.

Не обнаружено карбапенемрезистентных изолятов (в т. ч. МБЛ-продуцирующих), устойчивых к колистину, что позволяет рекомендовать данный препарат для терапии инфекций, вызванных госпитальными панрезистентными штаммами P.aeruginosa.