Единственным способом радикального лечения ге­мобластозов, врожденных анемий и коагулопатий явля­ется трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Основными источниками кроветворных клеток для подобных процедур являются пунктаты костного мозга и периферическая кровь после предварительной мобилиза­ции ГСК. Пуповинная кровь как наиболее безопасный и дешевый источник ГСК, несмотря на ряд очевидных пре­имуществ, применяется в основном при лечении детей из-за малых объемов трансплантата. Одним из способов решения данной проблемы является наращивание стволо­вых клеток в культуре.

Цель работы - определение оптимальных условий для наращивания ГСК пуповинной крови человека in vitro с сохранением их мультипотентного потенциала.

Сущность достижения - показана возможность нара­щивания in vitro мультипотентных кроветворных стволо­вых клеток пуповинной крови в 10-150 раз при культиви­ровании в течение недели.

Культивирование кроветворных ГСК по данным зару­бежных исследователей имеет ряд проблем. Показано, что клетки костного мозга и стимулированной периферической крови начинают быстро дифференцироваться, увеличива­ется количество апоптотических клеток, падает приживля­емость трансплантата (Kim J.M., 2006; Andrade-Zaldivar H., 2008; Faris Q., 2009). Наращивание ГСК пуповинной кро­ви более перспективно из-за наличия популяции ранних мультипотентных предшественников кроветворения, диф­ференцировка которых требует длительного времени. Этот дополнительный временной интервал может быть исполь­зован для получения в больших количествах стволовых клеток ex vivo без потери их кроветворной функции.

Нами изучены закономерности роста СК пуповинной крови in vitro. СК выделяли иммуномагнитной сепараци­ей положительных по антигену СD34 клеток. Параллель­но наращивание СК проводили из мононуклеарной фрак­ции клеток пуповинной крови. Для индукции пролифера­ции использовали смесь 4-х цитокинов: интерлейкина-3, интерлейкина-6, фактора роста стволовых клеток и лиган­да Fl-тирозинкиназы-3 в бессывороточной среде StemSpan (StemCell Thechn.).

Влияние подложки мезенхимальных стромальных клеток аллогенного костного мозга человека (МСК КМ) на поддержание роста изучали с помощью клоногенно­го теста в полужидкой питательной среде на основе ме­тилцеллюлозы (MethoCult, StemCell Thechn.). Количество мультипотентных предшественников кроветворения оце­нивали по содержанию смешанных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГЕММ). Количество стволовых CD34+ кле­ток на 0, 7 и 14-й день определяли методом проточной ци­тофлуориметрии.

В результате проведенных исследований показана воз­можность поддержания культуры ГСК в логарифмической фазе роста CD34+ клеток на протяжении 14 дней с увели­чением их количества за этот период более чем в 200 раз (от 17 до 340) при культивировании без подложки. Под­ложка МСК КМ способствовала дополнительному увели­чению количества CD34+ клеток в 2-10 раз, что позволи­ло нарастить CD34+ клетки более чем в 700 раз (105-1650) за тот же период. Количество КОЕ-ГЕММ увеличивалось в среднем в 245 раз для мононуклеарной и в 270 раз для CD34+-обогащенной фракции клеток пуповинной крови после 14 дней культивирования на подложке. В течение 1-й недели культивирования на подложке стромальных клеток наряду с дифференцировкой части ГСК наблюда­лось усиление содержания СD34+CD38-клеток, а также увеличение экспрессии CD34 антигена, что вместе с кло­ногенным тестом подтверждает наращивание более ран­них некоммитированных предшественников кроветворе­ния за этот период.

Таким образом, нами показана возможность значи­тельного увеличения количества ранних мультипотент­ных предшественников кроветворения in vitro. Оптималь­ными условиями для этого является культивирование кле­ток на подложке из МСК КМ в присутствии ростовых факторов в бессывороточной среде в срок до 1-й недели. В этот период количество ГСК увеличивается в среднем в 55 раз (10-150).