![]() |
УДК: 616.36-002.2/.-004-022.12-006.3-018.46-089.843:576.314.6/7
Год издания: 2010
Исследование потенциала дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в гепатоцитоподобные клетки in vitro
Исайкина Я.И., Лях Е.Г., Кустанович А.М., Алейникова О.В.
Рубрики: 76.29.34, 76.29.46
Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии
Тема НИР: «Разработка и внедрение технологии трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения хронического гепатита С и цирроза печени»
Сроки выполнения НИР: январь 2009 г. — декабрь 2010 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. В.М. Цыркунов, д-р мед. наук, проф. О.В. Алейникова, д-р мед. наук, проф. И.А. Карпов
Источник финансирования: госбюджет
Целью исследования являлось изучение возможности трансдифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в гепатоцитоподобные клетки in vitro для разработки нового метода применения аутотрансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для лечения хронического гепатита С и цирроза печени.
Изучению способности МСК дифференцироваться в гепатоциты in vitro и in vivo посвящено много работ. Большинство протоколов дифференцировки включает такие компоненты, как фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста фибробластов (FGF), онкостатин М, дексаметазон, при действии которых на МСК in vitro происходят изменения, которые затрагивают как морфологические, так и функциональные характеристики клеток. МСК приобретают так называемый гепатоцитоподобный фенотип. Наши исследования, проведенные в этом направлении, могут внести свой вклад в изучение потенциала дифференцировки МСК в гепатоцитоподобные клетки. Исследования направленной гепатогенной дифференцировки проводились на 8 образцах МСК, полученных из костного мозга здоровых доноров. МСК культивировали в присутствии 20 нг/мл HGF и 10 нг/мл FGF. Созревание клеток происходило в среде, содержащей 20 нг/мл онкостатина М, 1 ммоль/л дексаметазона, 50 мг/мл ITS + premix. Для подтверждения дифференцировки проводили морфологический анализ клеток, оценку экспрессии генов, отвечающих за синтез белков, специфичных для функционирующих гепатоцитов: HNF1a, Cyp3a4, цитокератина 18 (СК18), цитокератина 19 (СК19), альбумина и контрольного гена GAPDH в клетках до и после дифференцировки. Определяли содержание ?-фетопротеина в среде культивирования и способность клеток депонировать гликоген при культивировании в среде с повышенным содержанием глюкозы (ШИК-реакция).
Результаты исследования показали, что модификация оригинального фибробластоидного фенотипа МСК в полигональный фенотип гепатоцитоподобных клеток происходила после 21 дня направленной дифференцировки. Анализ результатов ШИК-реакции, проведенный на 5 образцах МСК, показал, что в культуре недифференцированных МСК окрашивания клеток в красный цвет не наблюдалось. Однако после дифференцировки МСК в гепатоцитоподобные клетки 27% (24-36%) из них окрашивались гематоксиллином, что доказывало наличие в их цитоплазме гликогена. Анализ ПЦР в реальном времени выявил, что экспрессия гена СK19 была слабо выражена в недифференцированных МСК и после дифференцировки, степень активации гена СК18 возрастала в гепатоцитоподобных клетках по сравнению с недифференцированными МСК. Активность гепатоспецифичного транскрипционного гена определяет тканеспецифический транскрипционный профиль гепатоцитов. Уровень HNF1a, фактора, функционирующего как в эмбриогенезе, так и при развитии постнатальной печени, возрастал к 14-му, а затем к 21-му дню и был значительно выше после 3-х недель направленной дифференцировки МСК в гепатоциты (0,0123±0,007 против 0,0001±0,000001, р<0,05). Экспрессия генов цитохрома cyp3A4 и альбумина также возрастала при направленной дифференцировке от 0 дня к 14-му и затем к 21-му дню и была достоверно выше в клетках после 3-х недель дифференцировки, чем в исходных МСК: 1,68±1,03 против 0,01±0,006 и 0,013±0,001 против 0,0002±0,000006 соответственно. Изучение динамики количества ?-фетопротеина в среде в зависимости от времени дифференцировки МСК в гепатоцитоподобные клетки показало, что МСК, подвергнутые направленной дифференцировке в гепатоциты, увеличивают синтез ?-фетопротеина, и максимальное количество белка обнаруживается через 3 недели дифференцировки.
Таким образом, нами показано, что степень активности генов, характерных для функционирующих гепатоцитов: HNF1a, Cyp3a4 и альбумина, при направленной дифференцировке МСК в гепатоциты in vitro под воздействием HGF, FGF и онкостатина М значительно усиливается. Изменение морфологии клеток в культуре и приобретение полигональной формы, а также секреция ими ?-фетопротеина и накопление гликогена доказывают, что часть МСК при определенных условиях культивирования дифференцируется в гепатоцитоподобные клетки, функционирующие подобно зрелым гепатоцитам.
Область применения: гепатология, трансплантология
Рекомендации по использованию: в ходе выполнения работы была доказана возможность дифференцировки МСК in vitro в гепатоцитоподобные клетки, частично функционирующие как зрелые гепатоциты, что подтверждает возможность использования МСК для репарации печени при тяжелых поражениях в центрах, где проводится трансплантация органов и тканей
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении