УДК: 616.36-002.2/.-004-022.12-006.3-018.46-089.843:576.314.6/7
Год издания: 2010

Исследование потенциала дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в гепатоцитоподобные клетки in vitro

Исайкина Я.И.Лях Е.Г.Кустанович А.М.Алейникова О.В.
Рубрики: 76.29.3476.29.46
Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии
Тема НИР: «Разработка и внедрение технологии трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения хронического гепатита С и цирроза печени»
Сроки выполнения НИР: январь 2009 г. — декабрь 2010 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. В.М. Цыркунов, д-р мед. наук, проф. О.В. Алейникова, д-р мед. наук, проф. И.А. Карпов
Источник финансирования: госбюджет

Целью исследования являлось изучение возможности трансдифференцировки мезенхимальных стволовых кле­ток в гепатоцитоподобные клетки in vitro для разработки нового метода применения аутотрансплантации мезенхи­мальных стволовых клеток (МСК) для лечения хрониче­ского гепатита С и цирроза печени.

Изучению способности МСК дифференцироваться в гепатоциты in vitro и in vivo посвящено много работ. Боль­шинство протоколов дифференцировки включает такие компоненты, как фактор роста гепатоцитов (HGF), фак­тор роста фибробластов (FGF), онкостатин М, дексаме­тазон, при действии которых на МСК in vitro происхо­дят изменения, которые затрагивают как морфологические, так и функциональные характеристики клеток. МСК приобретают так называемый гепатоцитоподобный фено­тип. Наши исследования, проведенные в этом направле­нии, могут внести свой вклад в изучение потенциала диф­ференцировки МСК в гепатоцитоподобные клетки. Иссле­дования направленной гепатогенной дифференцировки проводились на 8 образцах МСК, полученных из костно­го мозга здоровых доноров. МСК культивировали в при­сутствии 20 нг/мл HGF и 10 нг/мл FGF. Созревание кле­ток происходило в среде, содержащей 20 нг/мл онкоста­тина М, 1 ммоль/л дексаметазона, 50 мг/мл ITS + premix. Для подтверждения дифференцировки проводили морфо­логический анализ клеток, оценку экспрессии генов, от­вечающих за синтез белков, специфичных для функцио­нирующих гепатоцитов: HNF1a, Cyp3a4, цитокератина 18 (СК18), цитокератина 19 (СК19), альбумина и контроль­ного гена GAPDH в клетках до и после дифференциров­ки. Определяли содержание ?-фетопротеина в среде куль­тивирования и способность клеток депонировать гликоген при культивировании в среде с повышенным содержани­ем глюкозы (ШИК-реакция).­

Результаты исследования показали, что модификация оригинального фибробластоидного фенотипа МСК в по­лигональный фенотип гепатоцитоподобных клеток про­исходила после 21 дня направленной дифференцировки. Анализ результатов ШИК-реакции, проведенный на 5 об­разцах МСК, показал, что в культуре недифференциро­ванных МСК окрашивания клеток в красный цвет не на­блюдалось. Однако после дифференцировки МСК в гепа­тоцитоподобные клетки 27% (24-36%) из них окрашива­лись гематоксиллином, что доказывало наличие в их ци­топлазме гликогена. Анализ ПЦР в реальном времени вы­явил, что экспрессия гена СK19 была слабо выражена в недифференцированных МСК и после дифференцировки, степень активации гена СК18 возрастала в гепатоцитопо­добных клетках по сравнению с недифференцированны­ми МСК. Активность гепатоспецифичного транскрипци­онного гена определяет тканеспецифический транскрип­ционный профиль гепатоцитов. Уровень HNF1a, фак­тора, функционирующего как в эмбриогенезе, так и при развитии постнатальной печени, возрастал к 14-му, а за­тем к 21-му дню и был значительно выше после 3-х не­дель направленной дифференцировки МСК в гепатоци­ты (0,0123±0,007 против 0,0001±0,000001, р<0,05). Экс­прессия генов цитохрома cyp3A4 и альбумина также воз­растала при направленной дифференцировке от 0 дня к 14-му и затем к 21-му дню и была достоверно выше в клетках после 3-х недель дифференцировки, чем в исхо­дных МСК: 1,68±1,03 против 0,01±0,006 и 0,013±0,001 против 0,0002±0,000006 соответственно. Изучение дина­мики количества ?-фетопротеина в среде в зависимости от времени дифференцировки МСК в гепатоцитоподоб­ные клетки показало, что МСК, подвергнутые направлен­ной дифференцировке в гепатоциты, увеличивают синтез ?-фетопротеина, и максимальное количество белка обна­руживается через 3 недели дифференцировки.

Таким образом, нами показано, что степень активно­сти генов, характерных для функционирующих гепато­цитов: HNF1a, Cyp3a4 и альбумина, при направленной дифференцировке МСК в гепатоциты in vitro под воздей­ствием HGF, FGF и онкостатина М значительно усили­вается. Изменение морфологии клеток в культуре и при­обретение полигональной формы, а также секреция ими ?-фетопротеина и накопление гликогена доказывают, что часть МСК при определенных условиях культивирования дифференцируется в гепатоцитоподобные клетки, функ­ционирующие подобно зрелым гепатоцитам.


Область применения: гепатология, трансплантология
Рекомендации по использованию: в ходе выполнения работы была доказана возможность дифференцировки МСК in vitro в гепатоцитоподобные клетки, частично функционирующие как зрелые гепатоциты, что подтверждает возможность использования МСК для репарации печени при тяжелых поражениях в центрах, где проводится трансплантация органов и тканей
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2020 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта