Цель исследования: разработка метода диффе­ренцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондрогенные производные с использованием ма­триксных полимерных носителей, содержащих низко­молекулярные пептиды.

В результате проведенных экспериментов была отра­ботана методика выделения и получения из липоаспира­тов доноров популяции клеток, представленной в основ­ном клетками мезенхимального происхождения с низким содержанием эндотелиальных клеток, включающий фракцию стволовых клеток, обладающую способностью к дифференцировке в различные клеточные линии.

Отработаны подходы по определению иммунофе­нотипа мезенхимальных стволовых клеток адипозной ткани и проведена фенотипическая характеристика при анализе рецепторных СD маркеров с помощью методов проточной цитофлюорометрии. Подтверждена экспрес­сия ряда CD маркеров, таких как CD29 (98,9+1,1%), CD49b (96,2+1,5%), CD44 (99,9+1,0%), CD71 (84,0+2,9%), CD90 (89,9 + 1,0%), CD105 (87,1±1,3%), CD58 (64,7+1,1%), CD31 (3,1+1,7%), CD34 (3,3+0,9%), CD106 (1,3+1,6%), что свидетельствовало о принад­лежности клеток обработанной стромальной фракции к мезенхимальным стволовым клеткам жировой ткани. При этом одновременная экспрессия CD29 и CD105 на­блюдалась у 47,5% популяции.

Изучено влияние ряда ростовых факторов на гисто­морфологические показатели мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. Продемонстрирована амплифика­ция развития мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в хондрогенном направлении с помощью сочетанно­го воздейcтвия ростовых факторов TGF-b3/BMP-6 в 67% случаев при культивировании в высокой плотности. Усиле­ние функции дифференцируемых в хондрогенном направ­лении клеток мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани проявлялось в более интенсивной продукции компо­нентов экстрацеллюлярного матрикса (сульфатированных протеогликанов и коллагена 2 типа) по сравнению с культу­рами с монокомпонентным воздейстием TGF-b3 либо BMP-6 и культурами в стандартных условиях. Хондро­генная дифференцировка клеток была продемонстри­рована для 92% (11 из 12 образцов) при определении продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса (протеогликанов и коллагена 2 типа).

Исследованы морфологические и биохимические по­казатели мезенхимальных стволовых клеток при заклю­чении в различные полимерные матриксы, оцененa эф­фективность дифференцировки и уровень выхода диффе­ренцированных клеток при различных способах заключе­ния в матрикс. Наибольшая эффективность в плане хон­дрогенной дифференцировки была показана при заклю­чении недифференцированных мезенхимальных стволо­вых клеток в 2-4% матрикс в неполимеризованном со­стоянии на ранних этапах культивирования (1-8 пассаж) с добавлением TGF-b3/BMP-6 и культивировании в высо­кой плотности клеток (не менее 1х106кл/мл) с последую­щей полимеризацией в течение 10 минут. При этом уро­вень выхода дифференцированных в хондрогенном на­правлении клеток был наиболее высоким по сравнению с матриксами других типов при использовании более дли­тельного времени полимеризации, достигая 82,0+1,4%.

Проведено исследование морфофункциональной перестройки мезенхимальных стволовых клеток жиро­вой ткани в хондрогенные производные в составе 2-х типов матриксных полимерных носителей (альгинат­ного и желатинового) содержащих пептиды TGFbeta3 и BMP-6, CNP in vitro.

Установлено, что мезенхимальные стволовые клет­ки жировой ткани сохраняли высокий уровень жизне­способности не менее 96% на протяжении всего срока культивирования (21-е сут) в хондрогенных и контроль­ных условиях в обоих типах матриксов. Наблюдалась различная морфология клеток в составе матриксов: при культивировании в альгинатном матриксе для мезен­химальных стволовых клеток жировой ткани была ха­рактерна сферическая форма клеток, для желатинового матрикса - фибробластоподобная форма клеток. Со­держание глюкозаминогликанов в альгинатном матрик­се было значительно выше по сравнению с желатиновым в 4,03 раза и к 14-м сут в образцах с TGFbeta3+BMP-6 и достигало 10,9±0,25 мкг глюкозаминогликанов/мкг ДНК. Полученные данные свидетельствуют об эффек­тивности применения комплекса альгинатного матрикса и ростовых факторов TGFbeta3 +BMP-6 в отношении стимуляции хондрогенной дифференцировки мезенхи­мальных стволовых клеток жировой ткани, что прояв­ляется в усилении функциональной активности клеток и повышении продукции глюкозаминогликанов. При иммуногистохимической оценке продукции компонен­тов экстрацеллюлярного матрикса (коллагена 2 типа) и гистологическом определении сульфатированных про­теогликанов наблюдалось позитивное окрашивание во всех образцах. Интенсивность окраски кореллировала с показателями продукции глюкозаминогликанов и была наиболее выражена в альгинатных матриксах в группе TGFbeta3+BMP-6, что также подтверждает наибольшую эффективность применения комплекса TGFbeta3+BMP-6 и альгинатного матрикса для дифференцировки мезен­химальных стволовых клеток жировой ткани. В итоге исследования был составлен лабораторный протокол заключения мезенхимальных стволовых клеток жиро­вой ткани в матриксный носитель, обогащенный спец­ифическими полипептидными добавками, для создания оптимальных условий развития хондрогенной ткани.