Триптофан, серотонин и мелатонин вовлечены в регуляцию целого ряда физиологических и патологи­ческих процессов в организме человека и животных. Основная их роль - нейромедиаторы в ЦНС (поведен­ческие реакции: сон, бодрствование, аппетит, сексуаль­ность, ноцицепция; аффективные расстройства и др.). Имеются сведения о вовлечении триптофана и про­дуктов его превращений, в т.ч. мелатонина, в патоге­нетические механизмы заболеваний сердца и сосудов, включая сосудистые поражения ЦНС и возможность использования уровней продуктов гидроксилазного пути обмена триптофана для комплексной характери­стики метаболических нарушений у кардиологических пациентов.

Цель исследования: модифицировать метод анализа метаболитов триптофана, включая основные продукты гидроксилазного пути его превращений, для примене­ния в клинико-биохимических исследованиях.

Отработано определение метаболитов триптофана, включая продукты гидроксилазного пути его превра­щений, с помощью ВЭЖХ. Метод отличается от дру­гих селективностью, оптимизированной для биологи­ческих жидкостей (плазма крови).

Для анализа использовали гепаринизированную кровь, немедленно после забора осаждали форменные элементы центрифугированием при 1000 об/мин в те­чение 10 мин, отделяли плазму крови, содержащую тромбоциты. Аликвоту плазмы повторно центрифуги­ровали при 3000 об/мин в течение 15 мин (на холоду) для осаждения тромбоцитов, отделяли супернатант аспирацией для получения бестромбоцитарной плаз­мы. Определение содержания веществ в тромбоцитах осуществляли по разности концентраций, получен­ных для обеих проб. Осаждение белков 1 М раствором хлорной кислоты, содержащим 50 мг/л ЭДТА, 50 мг/л Na₂S₂O₅ и 1 мкМ ванилиновой кислоты с последующим центрифугированием при 4 ^°С в течение 15 мин при 16000g.

Условия разделения. Колонка Zorbax Eclipse XDB C₈, 3,5 мкм, 2,1х150 мм (Agilent Technologies), подвиж­ная фаза: 0,05 М NaH₂PO₄, 0,024 М CH₃COOH, 480 мг/л октилсульфоната натрия, 1,5 мл/л дибутиламина, 7% ацетонитрила (об.). Температура колонки 35 ^°С, ско­рость потока 0,2 мл/мин, объем ввода 40 мкл. Детек­тирование по флуоресценции (276/345 нм). Стандарты определяемых веществ: триптофан (Trp), 5-оксиин­долуксусная кислота (5-HIAA), N-ацетилсеротонин (NAS), N-ацетилтриптофан (NAT), серотонин (5-HT), 5-метоксииндолуксусная кислота (MIAA), мелатонин (Mel), 5-метокситриптамин (5MT), триптамин (TRN). Хроматограмма стандартной смеси представлена на рис. 1, типичная хроматограмма хлорнокислого экс­тракта плазмы крови - на рис. 2.

Для определения 5-окситриптофана (5-HTP) исполь­зовали модификацию метода, отличающуюся примене­нием вместо электрохимического детектирования по природной флуоресценции, которое отличается мень­шими требованиями к точности условий определения и большей стабильностью параметров. Условия разделе­ния: колонка 3х250 мм Separon SGX C₁₈, 8 мкм (Элси­ко, Россия) температура 27 ^°С. Подвижная фаза: 0,1 М KH₂PO₄, 0,017 M CH₃COOH, pH 3,65; 180 мг/л гептил­сульфоната натрия, 180 мг/л октилсульфоната натрия, 50 мг/л ЭДТА, 10% (об.) метанола. Скорость потока 0,5 мл/мин. Детектирование по флуоресценции: 280/340 нм. Количественная обработка хроматограмм - с ис­пользованием метода внутреннего стандарта. В данной системе возможно определение уровней триптофана, 5-окситриптофана, серотонина, 5-оксииндолуксусной кислоты. Типичная хроматограмма приведена на рис. 3 (стандарты), 4 (плазма, содержащая тромбоциты) и 5 (плазма, свободная от тромбоцитов).

Данный метод позволяет одновременно опреде­лять концентрации триптофана и его основных био­логически активных метаболитов в плазме крови или форменных элементах при минимальной процеду­ре пробоподготовки и пригоден для применения в клинико-биохимических исследованиях, в том числе для разработки способов метаболической коррекции.

Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси метаболитов триптофана и родственных соединений, 100 мкМ
Рис. 2. Типичная хроматограмма хлорнокислого экстракта плазмы крови человека
Рис. 3. Хроматограмма стандартной смеси биогенных аминов, их предшественников и метаболитов, 100 мкМ
Типичная хроматограмма хлорнокислого экстракта плазмы крови человека, обогащенной тромбоцитами (фракция, содержащая тромбоциты)
Рис. 5. Типичная хроматограмма хлорнокислого экстракта плазмы крови человека, свободная от тромбоцитов