![]() |
УДК: 578.825.11-085:[615.015:281.8]:57.063.8(476)
Год издания: 2011
Выделение ацикловиррезистентных штаммов вирусов герпеса, циркулирующих на территории Республики Беларусь
Полещук Н.Н., Бореко Е.И., Рубаник Л.В., Савинова О.В.
Рубрики: 34.25.00, 34.25.39
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать систему мониторинга лекарственной устойчивости герпесвирусов и создать тест-систему для их идентификации»
Сроки выполнения НИР: 01.01.2011 г. — 31.12.2016 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. Н.Н. Полещук, д-р мед. наук Е.И. Бореко
Источник финансирования: госбюджет
Цель исследования: выделение и изучение фенотипической чувствительности штаммов вируса простого герпеса к ацикловиру.
Исследования проведены на клиническом и экспериментальном материале. Обследовано 79 пациентов с урогенитальной патологией. Из них отобрано 23 человека (17 женщин и 6 мужчин) с репродуктивными нарушениями (бесплодие - 16, неразвивающаяся беременность - 3, самопроизвольный выкидыш - 4). В анамнезе у части пациентов 12 из 23 (52,17%) были неоднократные эпизоды герпетических высыпаний. Большинство (19 из 23 - 82,6%) сообщало о ранее подтвержденном лабораторном диагнозе «герпетическая инфекция» и прохождении неоднократных курсов противогерпетической терапии.
Всем пациентам проведено комплексное лабораторное исследование клинического материала (мазков-соскобов из урогенитального тракта, сыворотки крови) с использованием культурального метода, метода флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР).
При исследовании соскобного материала в 20 из 23 проб (86,96%) на культуре клеток установлено характерное для герпесвирусов цитопатическое действие (гигантские клетки с крупным ядром, вакуолизация цитоплазмы, слияние клеток с образованием синцития и др.). При обработке культуры клеток флуоресцирующими противогерпетическими антителами наблюдалось специфическое свечение вирусных антигенов - от очагов в форме глыбок в ядрах и околоядерной цитоплазме до диффузного свечения всей зараженной клетки. ДНК вируса герпеса простого и ДНК цитомегаловируса определена методом ПЦР у 14 из 23 (60,87%) и у 3 из 23 (13,04%) пациентов соответственно.
Методом ИФА в сыворотке крови у 16 из 23 (69,57%) обследуемых выявлены противогерпетические IgM, причем у 11 (47,83%) - IgM к вирусу герпеса простого и у 4 (17,39%) - IgM к цитомегаловирусу, у 2 (8,7%) - IgM к вирусу герпеса простого и цитомегаловирусу одновременно.
В результате выделено три изолята вируса герпеса простого и проведено сравнительное изучение их биологических свойств. Репродуктивная активность изолятов варьировала от 4,5 до 5,25 ТЦД50/мл, уровень экспрессии вирусных антигенов (интенсивность свечения) колебался от 3+ до 4+. С помощью электронной микроскопии у 2 изолятов вируса герпеса изучены основные стадии морфогенеза и ультраструктура. Ультраструктурный анализ показал сохранность всех этапов морфогенеза: формирование внутриядерных нуклеокапсидов, почкование на ядерных мембранах и выход «зрелых» сформированных вирусных частиц во внеклеточное пространство путем цитолиза. Размер нуклеокапсида составлял 80 - 110 нм, зрелого вириона - 200-240 нм.
Выделенные изоляты адаптированы к клеточной линии МсСоу и RD и накоплены для изучения in vitro фенотипической чувствительности к ацикловиру. Определение фенотипической чувствительности изолятов проводили, исследуя противовирусное действие различных концентраций ацикловира и вычисляя концентрации препарата, подавляющие размножение вируса на 50% (ЕС50) и концентрации ацикловира, подавляющие размножение вируса на 90% (ЕС90). Для этого прежде всего, были изучены противовирусные свойства трех лекарственных форм ацикловира (препарат А, препарат В, препарат С) в отношении лабораторного вируса герпеса I типа (штамм 1 С). При этом установлено более чем десятикратное различие в значениях ЕС50. Показано, что наиболее активным был препарат А. In vitro действие данного препарата в отношении выделенных изолятов вируса герпеса вызывает снижение чувствительности изолятов от пациента П. в сравнении с чувствительностью лабораторного штамма вируса (ЕС50 и ЕС90 ниже в 44 и 32 раза соответственно), от пациентки Р. (ЕС50 и ЕС90 ниже в 268 и 106 раз соответственно). Изолят от пациента Д. был полностью резистентен к действию ацикловира (препарата А) во всем диапазоне исследованных концентраций, начиная с 800 мкг/мл.
Полученные данные свидетельствуют о штаммовых различиях вируса простого герпеса и различной чувствительности их к ацикловиру. На территории Республики Беларусь циркулируют штаммы вируса герпеса частично или полностью устойчивые к ацикловиру, что указывает на необходимость разработки доступных методик и тест-систем, определяющих как фенотипическую, так и генотипическую резистентность вирусов герпеса к препарату.
Область применения: вирусология, лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: результаты работы могут быть внедрены в практическое здравоохранение для выделения и определения чувствительности изолятов к ацикловиру при тяжелых генерализованных формах герпетической инфекции.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по указанной тематике.