УДК: 617-089.844:[616.98:578:27]-07
Год издания: 2011

Разработка ПЦР в реальном времени для диагностики посттрансплантационных ВК-вирусных осложнений

Амвросьева Т.В.Поклонская Н.В.Безручко А.А.Кишкурно Е.П.Калачик О.В.
Рубрики: 76.35.33
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать и внедрить способ ранней диагностики вирусных осложнений у реципиентов после трансплантации почки, изучить их этиологическую структуру»
Сроки выполнения НИР: 2011 г. — 2015 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. Амвросьева Т.В.
Соисполнители: УЗ «9-я городская клиническая больница» г. Минска
Источник финансирования: госбюджет

ВК-вирус (род Polyomavirus) - широко распро­страненный в человеческой популяции вирусный агент. Первичное инфицирование им происходит в раннем детстве и протекает, как правило, бессимптомно, после чего инфекция переходит в латентную фазу, во время которой вирус сохраняется в клетках мочевыводящей системы и лимфоцитах.

Инфекция, вызванная ВК-вирусом, приводит к тяже­лым осложнениям у пациентов после трансплантации. Выделение ВК-вируса с мочой имеет место у значитель­ного числа пациентов (10-60%) после трансплантации почки, а развитие нефропатии, ассоциированной с ВК-вирусом, регистрируется у 8% реципиентов, что в тече­ние последующих 2-3-х лет приводит к потере транс­плантата у 50% этих лиц. Снижение иммуносупрессии у пациентов после трансплантации приводит к значитель­ному увеличению титров специфических антител, акти­визации ВК-специфического клеточного иммунитета, исчезновению виремии и стабилизации функции транс­плантата. Исходя из этого, диагностика ВК-вирусной инфекции у пациентов после трансплантации почки, по­зволяющая контролировать развитие вирурии, виремии, вирусного поражения тканей почки и уровни вирусной нагрузки, является чрезвычайно важным инструментом для предотвращения развития посттрансплантацион­ных осложнений. Основным методом диагностики ВК-вирусной инфекции на сегодняшний день является ПЦР в реальном времени, в т.ч. ее количественная модифи­кация, позволяющая оценить динамику изменения ви­русной нагрузки у пациентов. В связи с отсутствием на отечественном рынке коммерческих диагностических препаратов целью работы была разработка ПЦР в реаль­ном времени для выявления ВК-вирусной инфекции у пациентов после трансплантации.

На первом этапе было выбрано несколько наборов праймеров и зондов и проведен компьютерный ана­лиз для определения консервативности сайтов их свя­зывания, а также установления основных параметров выбранных олигонуклеотидов (температура отжига, наличие димеров, кросс-димеров и сайтов неспецифи­ческого связывания). На основании этого анализа были выбраны два набора праймеров и зондов, локализован­ных в участках генома, кодирующих капсидный белок VP1 (BK-V3f, BK-V3r, BK-V3p) и большой Т-антиген (BK- T3f, BK-T3r, BK-T3p). В качестве метки на 5′-кон­це зонда использовали FAM, в качестве гасителя флюо­ресценции на 3′-конце - BHQ-1. Оценка эффективности ПЦР при независимом использовании каждого из на­боров праймеров на 8 образцах мочи реципиентов поч­ки выявила 37,5% положительных результатов. Спец­ифичность связывания праймеров с ДНК ВК-вируса иузчена по пробам клинического материала, в которых ранее обнаружено присутствие ДНК других вирус­ных агентов: ЦМВ (1 проба), ВЭБ (2 пробы), ВГЧ 6 (1 проба), ВПЧ 1 и 2 типов (8 проб) и Parvovirus B19 (1 проба). Ни в одной из исследованных проб ДНК не ам­плифицировалась, что свидетельствовало о специфич­ности взаимодействия исследуемых праймеров только с ДНК ВК-вируса.

В целях оптимизации реакции применялись ПЦР-буферы различного состава и разных концентраций MgCl2, что в конечном итоге не влияло на ее эффектив­ность. Вместе с тем постановка реакции с одновремен­ным использованием 2 наборов праймеров и зондов позволила значительно увеличить ее чувствитель­ность: среднее значение Ct при использовании набора праймеров T3 равнялось 33, при постановке с набором V3-34,5, тогда как при одновременном использовании T3+V3 среднее значение Ct составило 20. Оптимизи­рованный температурный профиль реакции состоял из 45 циклов денатурации при 95° С в течение 10 секунд и объединенной стадии отжига-элонгации при 60° С в течение 40 с.

Для проведения пилотных испытаний разработан­ной методики были использованы пробы мочи и сыво­ротки крови пациентов, отобранные в различные сроки после трансплантации почки у пациентов с клиниче­скими признаками инфекции (n=23, 1-я группа) и у лиц без инфекционных осложнений (n=15, 2-я группа). Полученные результаты показали, что ДНК ВК-вируса была обнаружена в моче у 17,4% пациентов 1-й груп­пы и 13,3% пациентов 2-й группы. Присутствие ДНК в сыворотке крови, свидетельствующее о виремии, было выявлено у 4,3% пациентов в 1-й группе и ни у одного во 2-й группе. Повторные исследования проб, взятых с интервалом 2 недели, показали, что вирурия сохраня­лась в течение >1 мес. у 8,7% пациентов 1-й группы и 6,7% пациентов 2-й группы.

Разработанная методика выявления ВК-вируса с помощью ПЦР в реальном времени, позволяющая эф­фективно определять вирусспецифическую ДНК в сы­воротке крови и моче пациентов, рекомендуется для широкого использования в практике для ранней диа­гностики ВК-вирусной инфекции.


Область применения: клиническая лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: учреждения здравоохранения, осуществляющие трансплантацию органов и тканей.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта