Цель исследования: разработка технологии полу­чения и организация производства стандартизирован­ного по Международному Индексу Чувствительности (МИЧ) высокочувствительного реагента тромбопла­стин, предназначенного для использования в комплек­се лабораторно-диагностических мероприятий, а также реагента тромбопластин-активатор для производствен­ных целей.

В результате проведенной научно-исследовательской работы разработаны две технологические схемы по­лучения хорошо растворимого диагностического реа­гента тромбопластин из различных источников био­логического сырья (плацента человека, мозг кролика, кадаверный мозг). Разработанные технологические схемы производства включают в качестве основных стадий гомогенизацию, очистку (с использованием ор­ганических растворителей) и лиофилизацию позволя­ющие получить реагент, обладающий высокой актив­ностью и чувствительностью (МИЧ 1.1-1.2), а также обладающий чувствительностью к снижению актив­ности факторов протромбинового комплекса под дей­ствием непрямых антикоагулянтов. За счет добавления стабилизаторов, криопротекторов и антиоксидантов в определенных соотношениях данная технология по­зволяет получать стабильные экстракты и готовые рас­творимые формы реагентов способные сохранять свои свойства до и после лиофилизации и в течение всего срока хранения продукта. На основе созданной техно­логии произведены отечественные высокочувствитель­ные стандартизированные реагенты тромбопластин «Диапластин», «Диапластин жидкий» с учетом требо­ваний ВОЗ к производимой продукции. Полученные реагенты используются в диагностических целях с воз­можностью определения Международного нормализо­ванного отношения (МНО) для оптимизации подбора дозы антикоагулянтов непрямого действия.

Проведены исследования по изучению спектра фос­фолипидов методами тонкослойной хроматографии разработанных образцов тромбопластина лиофилизи­рованной и жидкой формы в сравнительном анализе с коммерческими аналогами («Tromborel S», Германия, лиофилизированная форма; «Helena Thromboplastin Li», Англия, жидкая форма). Экстракцию липидов из каждого образца реагента тромбопластин проводили по методу Фолча. Суммарное содержание фосфора в исследуемых образцах было определено по методу Васьковского. Разделение фосфолипидных экстрактов из образцов тромбопластина на индивидуальные ком­поненты проводили с помощью тонкослойной хрома­тографии на силикагеле. На алюминиевые пластинки с силикагелем наносили 100 мкл экстракта и хрома­тографировали в системах растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4, по объему). Пластинки высу­шивали и обрызгив али реагентом на фосфолипиды для обнаружения всех фосфолипидных компонентов пре­парата. Зоны, окрашенные на пластинке в синий цвет, соскабливали и определяли в них содержание фосфора.

При получении спектра фосфолипидов установлен процент содержания фосфатидилэтаноламинов и фос­фатидилхолинов в отечественных образцах в сравни­тельной характеристике с импортными образцами. Ре­зультаты исследований представлены в таблице 1.

Следует отметить, что лиофилизированные формы реагентов «Диапластин» и «Tromborel S» отличаются по содержанию фосфатидилэтаноламинов и фосфати­дилхолинов от жидких форм реагентов «Диапласти­на жидкого» и «Helena Thromboplastin Li», однако на основные характеристики реагентов - активность и чувствительность это отличие существенно не влияет.

Дополнительно исследован фосфолипидный про­филь образцов тромбопластина с помощью спектро­скопии ³¹Р ЯМР. Спектры ³¹Р ЯМР регистрировали на приборе Bruker Avance-500. В полученных спектрах при достаточном количестве образца сигналы ядер фосфора нейтральных и кислых фосфолипидов раз­деляются. По соотношению этих сигналов можно су­дить о соотношении вышеуказанных фосфолипидов в образцах. В спектрах фосфолипидных экстрактов как лиофильно высушенных, так и жидких формах тром­бопластинов соотношение сигналов ядер фосфора ней­тральных и кислых фосфолипидов указывает на схо­жий фосфолипидный состав.

Электрофоретические исследования белковой со­ставляющей реагентов на основе тканевого тромбопла­стина проводили методом разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электро­форетической подвижностью (SDS-PAGE по Лэммли). Исследования проводились с целью приблизительной оценки количества белка и его чистоты в разработан­ных образцах тромбопластина («Диапластин», «Диа­пластин жидкий») в сравнительной характеристике с зарубежными образцами («Tromborel S», Германия, лиофилизированная форма; «Helena Thromboplastin Li», Англия, жидкая форма). В результате проведенной работы препараты тромбопластина как коммерческие, так и нами произведенные не отличаются высокой чи­стотой, помимо тканевого фактора в них содержатся сопутствующие белки тканей/крови, что в свою оче­редь не влияет на работу реагентов. Следовательно, белковая составляющая тканевого тромбопластина разработанных диагностических реагентов схожа по своей структуре с импортными аналогами.

При изучении стабильности в процессе хранения реагентов «Диапластин» и «Диапластин жидкий» уста­новлено, что как готовые формы, так и рабочие раство­ры сохраняют свои физико-химические свойства в со­поставимые сроки с коммерческими аналогами.

Таким образом, разработанная технология позволя­ет получать высокочувствительные диагностические реагенты на основе тканевого тромбопластина «Диа­пластин» с МИЧ 1,05-1,09 и «Диапластин жидкий» с МИЧ 1,12-1,18. Международный индекс чувствитель­ности импортных диагностических реагентов варьиру­ется в пределе от 1,02 до 1,18 в зависимости от произ­водителя и формы выпуска. Следовательно, величина МИЧ разработанных нами реагентов сопоставима с величиной МИЧ зарубежных аналогов. Данный факт свидетельствует о соответствии характеристик произ­водимых реагентов импортным образцам. Использова­ние отечественных реагентов в клинико-лабораторной практике будет способствовать улучшению качества диагностики и мониторинга терапии лиц с достаточно широким спектром заболеваний, а также значительно­му валютосбережению.

Тромбопластин-активатор как реагент востребован в качестве активатора протромбина в производстве препаратов крови и используется для собственного производства. Потребность отечественной медицины в диагностическом реагенте достаточно высока и состав­ляет не менее 1000000 анализов в год, это 100000000 флаконов - 10000000 наборов. Учитывая эти обстоя­тельства, получаемые диагностические реагенты «Диа­пластин» и «Диапластин жидкий» на основе тканево­го тромбопластина, производимые по разработанной нами технологии, могут иметь экспортную направлен­ность. Экономическая эффективность определяется на основании оценки стоимости имеющихся импортных диагностических наборов стоимостью от 26 долларов США (фирма «Технология-Стандарт», Россия) до 40 долларов США (фирма «Cormay», Польша) за набор на 100 определений протромбинового времени. Учиты­вая что ориентировочная стоимость разрабатываемого диагностического набора реагента тромбопластин со­ставляет порядка 17 долларов США, экономический эффект создания отечественного набора для опреде­ления протромбинового времени составит до 1,4 млн. долларов США в год.