УДК: 577.112.854:616.15
Год издания: 2011

Содержание гликозилированных форм L- и Н-ферритина в сыворотке крови человека при заболеваниях крови. Разработка тест-системы для иммуноферментного анализа гликозилированного ферритина

Кравчук З.И.Смирнова Л.А.Козич Ж.М.Фима Д.В.Рачицкая В.В.Трухан А.Л.Марцев С.П.
Рубрики: 76.03.3176.29.33
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Разработать тест-систему для определения содержания гликозилированной и негликозилированной форм L- и Н-ферритинов в сыворотке крови, на основе полученной тест-системы изучить содержание указанных изоформ ферритинов при заболеваниях крови»
Сроки выполнения НИР: I кв. 2009 г. — IV кв. 2010 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук Л.А. Смирнова, канд. хим. наук. З.И. Кравчук
Соисполнители: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»
Источник финансирования: госбюджет

Ферритин представляет собой белок, который на­капливает и хранит в организме железо в нетоксичной и биологически доступной форме. В соответствии с этим ферритин сыворотки крови традиционно ис­пользовался в качестве маркера дефицита и избытка железа в организме. В дальнейшем было установлено, что ферритин является также одним из белков острой фазы воспаления, а в последние годы ферритин из­учается как онкологический маркер. Молекула фер­ритина человека состоит их двух видов субъединиц: L (легкая, 19,9 кДа) и Н (тяжелая, 22 кДа). Функции субъединиц ферритина различны и в настоящее время до конца не выяснены. Известно, что в метаболизме железа Н-субъединицы проявляют ферроксидазную активность, а L-цепи способствуют нуклеации желе­за, окисленного Н-субъединицами. Согласно послед­ним данным Н-ферритин участвует также в регуляции клеточной пролиферации и гемопоэза (для обзора см. Recalcati et al., 2008). Опубликованные в настоящее время данные носят разрозненный характер, оконча­тельного ответа на вопрос о причинах аномально вы­сокого содержания ферритина при онкологических процессах, его происхождении и роли гиперферрити­немии не получено. Следовательно, при анализе роли ферритина в онкологических заболеваниях необходимо исследовать содержание как L-, так и Н-субъединицы. Оценивая абсолютное содержание L- и Н-ферритина в сыворотке крови, очень важно выявить, какая часть ферритинов секретируется лейкозными клетками (гли­козилированный ферритин), а какая часть выделяется при разрушении клеток, связанном с усиленным апоп­тозом на фоне противоопухолевой терапии (негликози­лированная форма ферритина).

Цель исследования: разработка тест-системы для определения гликозилированной и негликозилиро­ванной форм L- и H-ферритинов и установление воз­можности использования данных форм для прогнози­рования течения и мониторинга терапии лейкозов и миелодиспластических синдромов.

Объектом исследования являлись L- и Н-ферритины человека и их гликозилированные формы у здоровых людей и пациентов с заболеваниями крови.

Сущность достижения и его новизна заключаются в создании тест-системы для определения гликозилиро­ванных и негликозилированных форм L- и Н-ферритинов человека в сыворотке крови. Впервые получены данные о содержании гликозилированных и негликозилирован­ных форм ферритина при острых и хронических лейко­зах, миелодиспластическом синдроме.

Установлено диагностическое и прогностическое значение изоформ ферритина при лейкозах.

Разработана тест-система для определения гликози­лированных форм L- и Н-ферритина в сыворотке крови человека. В данной тест-системе реализована возмож­ность одновременного определения суммарного и гли­козилированного L- и H-ферритина.

Для разработки метода определения концентра­ции L-ферритина нами был получен рекомбинантный L-ферритин человека, моноклональные антитела к нему и их аналоги, модифицированные биотином или пероксидазой хрена. В основу большинства современ­ных иммунодиагностикумов положен двуцентровый анализ, в котором ферритин калибровочных проб или исследуемых сывороток вначале взаимодействует с антителом, иммобилизованным в лунках полисти­рольного планшета, а затем с меченным антителом. Необходимым условием является иммунохимическая идентичность антигена калибровочных проб и иссле­дуемых образцов, особенно для таких сложных белков, как ферритин, имеющих большое число возможных конформаций. Поэтому диагностические системы ка­либруют по белкам (антигенам), принятым в качестве стандарта ВОЗ. В настоящее время стандартом ферри­тина ВОЗ является рекомбинантный L-ферритин.

Для иммунохимически идентичных образцов анти­гена зависимость концентрации, определенной в дан­ной аналитической системе, от ожидаемой должна иметь вид прямой, совпадающей или параллельной теоретической. Проведенные исследования показали, что ферритин сыворотки крови доноров и пациентов с острыми лейкозами иммунохимически идентичен по­лученному нами рекомбинантному L-ферритину.

В процессе разработки метода определения Н-ферритина также был получен рекомбинантный Н-ферритин, моноклональные антитела к данному белку и их аналоги, модифицированные биотином и пероксидазой хрена. Иммуноферментный анализ Н-ферритина является твердофазным анализом с ис­пользованием пары моноклональных антител к различ­ным антигенным детерминантам молекулы ферритина. Анализ проводится в три стадии. Во время первой ин­кубации Н-ферритин, присутствующий в пробах сыво­ротки крови или калибровочных пробах, связывается с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках планшета, во время второй инкубации - с моноклональными антителами, меченными биотином, во время третьей - биотин взаимодействует с авидином (стрептавидином), меченным пероксидазой хрена. Диа­пазон определяемых концентраций Н-ферритина - от 0 до 100 нг/мл. Чувствительность тест-системы - не более 0,1 нг/мл. В разработанной тест-системе реком­бинантный Н-ферритин иммунохимически иденти­чен ферритину сыворотки крови людей, страдающих острым лейкозом и доноров.

Удаление из образца гликозилированного ферри­тина осуществляли путем инкубации с конканавалин A-сефарозой (Sigma). Несвязанный (негликозилировн­ный) L- и Н-ферритин определяли в супернатанте методом иммуноферментного анализа. Суммарный L- и Н-ферритин определяли в супернатанте после инкуба­ции с сефарозой 4В. Содержание гликозилированного ферритина представляет собой разность между уров­нями суммарного и негликозилированного ферритина.­

Содержание гликозилированного ферритина в сы­воротке крови здоровых людей и пациентов с заболева­ниями крови. С помощью разработанной тест-системы проведено определение уровня L- и H-ферритинов, а также их гликозилированных форм в сыворотках кро­ви здоровых людей (n=45) и пациентов с лейкозами и миелодиспластическими синдромами. Показано, что содержание L-ферритина в сыворотке крови здоро­вых людей без учета пола составляет 72,6±14,0 нг/мл, H-ферритина - 12,5±2,4 нг/мл, а их гликозилирован­ных форм - 86,8±6,9 и 72,9±14,1 % соответственно. По­лученные результаты свидетельствуют о секреторном происхождении ферритина в сыворотке крови.

При острых и хронических лейкозах уровень гли­козилированного L- ферритина достоверно снижается до 60-70 и 25-50% соответственно. Падает также со­держание гликозилированной формы Н-ферритина. Можно предположить, что секреция ферритинов свя­зана с его регуляторными функциями и, возможно, от­ражает объем пролиферирующего опухолевого клона, поскольку при ремиссиях острых лейкозов уровни ферритинов приближаются к нормальным величинам. Снижение уровня гликозилированных форм феррити­на, возможно, обусловлено также нарушением процес­сов клеточного метаболизма и апоптоза при онкогема­тологических заболеваниях.

Данные о содержании L- и Н-изоформ ферритина, а также их гликозилированных и негликозилированных форм могут быть использованы для целей прогноза и мониторинга терапии при заболеваниях крови.


Область применения: онкология, гематология, клиническая лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: в научных исследованиях и для диагностики и прогнозирования течения лейкозов и анемий.
Предложения по сотрудничеству: совместные работы по оценке уровня ферритина и его гликозилированных и негликозилированных форм в сыворотке крови человека.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта