УДК: 577.112.854:616.15
Год издания: 2011
Содержание гликозилированных форм L- и Н-ферритина в сыворотке крови человека при заболеваниях крови. Разработка тест-системы для иммуноферментного анализа гликозилированного ферритина
Кравчук З.И., Смирнова Л.А., Козич Ж.М., Фима Д.В., Рачицкая В.В., Трухан А.Л., Марцев С.П.
Рубрики: 76.03.31, 76.29.33
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Разработать тест-систему для определения содержания гликозилированной и негликозилированной форм L- и Н-ферритинов в сыворотке крови, на основе полученной тест-системы изучить содержание указанных изоформ ферритинов при заболеваниях крови»
Сроки выполнения НИР: I кв. 2009 г. — IV кв. 2010 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук Л.А. Смирнова, канд. хим. наук. З.И. Кравчук
Соисполнители: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»
Источник финансирования: госбюджет
Ферритин представляет собой белок, который накапливает и хранит в организме железо в нетоксичной и биологически доступной форме. В соответствии с этим ферритин сыворотки крови традиционно использовался в качестве маркера дефицита и избытка железа в организме. В дальнейшем было установлено, что ферритин является также одним из белков острой фазы воспаления, а в последние годы ферритин изучается как онкологический маркер. Молекула ферритина человека состоит их двух видов субъединиц: L (легкая, 19,9 кДа) и Н (тяжелая, 22 кДа). Функции субъединиц ферритина различны и в настоящее время до конца не выяснены. Известно, что в метаболизме железа Н-субъединицы проявляют ферроксидазную активность, а L-цепи способствуют нуклеации железа, окисленного Н-субъединицами. Согласно последним данным Н-ферритин участвует также в регуляции клеточной пролиферации и гемопоэза (для обзора см. Recalcati et al., 2008). Опубликованные в настоящее время данные носят разрозненный характер, окончательного ответа на вопрос о причинах аномально высокого содержания ферритина при онкологических процессах, его происхождении и роли гиперферритинемии не получено. Следовательно, при анализе роли ферритина в онкологических заболеваниях необходимо исследовать содержание как L-, так и Н-субъединицы. Оценивая абсолютное содержание L- и Н-ферритина в сыворотке крови, очень важно выявить, какая часть ферритинов секретируется лейкозными клетками (гликозилированный ферритин), а какая часть выделяется при разрушении клеток, связанном с усиленным апоптозом на фоне противоопухолевой терапии (негликозилированная форма ферритина).
Цель исследования: разработка тест-системы для определения гликозилированной и негликозилированной форм L- и H-ферритинов и установление возможности использования данных форм для прогнозирования течения и мониторинга терапии лейкозов и миелодиспластических синдромов.
Объектом исследования являлись L- и Н-ферритины человека и их гликозилированные формы у здоровых людей и пациентов с заболеваниями крови.
Сущность достижения и его новизна заключаются в создании тест-системы для определения гликозилированных и негликозилированных форм L- и Н-ферритинов человека в сыворотке крови. Впервые получены данные о содержании гликозилированных и негликозилированных форм ферритина при острых и хронических лейкозах, миелодиспластическом синдроме.
Установлено диагностическое и прогностическое значение изоформ ферритина при лейкозах.
Разработана тест-система для определения гликозилированных форм L- и Н-ферритина в сыворотке крови человека. В данной тест-системе реализована возможность одновременного определения суммарного и гликозилированного L- и H-ферритина.
Для разработки метода определения концентрации L-ферритина нами был получен рекомбинантный L-ферритин человека, моноклональные антитела к нему и их аналоги, модифицированные биотином или пероксидазой хрена. В основу большинства современных иммунодиагностикумов положен двуцентровый анализ, в котором ферритин калибровочных проб или исследуемых сывороток вначале взаимодействует с антителом, иммобилизованным в лунках полистирольного планшета, а затем с меченным антителом. Необходимым условием является иммунохимическая идентичность антигена калибровочных проб и исследуемых образцов, особенно для таких сложных белков, как ферритин, имеющих большое число возможных конформаций. Поэтому диагностические системы калибруют по белкам (антигенам), принятым в качестве стандарта ВОЗ. В настоящее время стандартом ферритина ВОЗ является рекомбинантный L-ферритин.
Для иммунохимически идентичных образцов антигена зависимость концентрации, определенной в данной аналитической системе, от ожидаемой должна иметь вид прямой, совпадающей или параллельной теоретической. Проведенные исследования показали, что ферритин сыворотки крови доноров и пациентов с острыми лейкозами иммунохимически идентичен полученному нами рекомбинантному L-ферритину.
В процессе разработки метода определения Н-ферритина также был получен рекомбинантный Н-ферритин, моноклональные антитела к данному белку и их аналоги, модифицированные биотином и пероксидазой хрена. Иммуноферментный анализ Н-ферритина является твердофазным анализом с использованием пары моноклональных антител к различным антигенным детерминантам молекулы ферритина. Анализ проводится в три стадии. Во время первой инкубации Н-ферритин, присутствующий в пробах сыворотки крови или калибровочных пробах, связывается с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках планшета, во время второй инкубации - с моноклональными антителами, меченными биотином, во время третьей - биотин взаимодействует с авидином (стрептавидином), меченным пероксидазой хрена. Диапазон определяемых концентраций Н-ферритина - от 0 до 100 нг/мл. Чувствительность тест-системы - не более 0,1 нг/мл. В разработанной тест-системе рекомбинантный Н-ферритин иммунохимически идентичен ферритину сыворотки крови людей, страдающих острым лейкозом и доноров.
Удаление из образца гликозилированного ферритина осуществляли путем инкубации с конканавалин A-сефарозой (Sigma). Несвязанный (негликозилировнный) L- и Н-ферритин определяли в супернатанте методом иммуноферментного анализа. Суммарный L- и Н-ферритин определяли в супернатанте после инкубации с сефарозой 4В. Содержание гликозилированного ферритина представляет собой разность между уровнями суммарного и негликозилированного ферритина.
Содержание гликозилированного ферритина в сыворотке крови здоровых людей и пациентов с заболеваниями крови. С помощью разработанной тест-системы проведено определение уровня L- и H-ферритинов, а также их гликозилированных форм в сыворотках крови здоровых людей (n=45) и пациентов с лейкозами и миелодиспластическими синдромами. Показано, что содержание L-ферритина в сыворотке крови здоровых людей без учета пола составляет 72,6±14,0 нг/мл, H-ферритина - 12,5±2,4 нг/мл, а их гликозилированных форм - 86,8±6,9 и 72,9±14,1 % соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о секреторном происхождении ферритина в сыворотке крови.
При острых и хронических лейкозах уровень гликозилированного L- ферритина достоверно снижается до 60-70 и 25-50% соответственно. Падает также содержание гликозилированной формы Н-ферритина. Можно предположить, что секреция ферритинов связана с его регуляторными функциями и, возможно, отражает объем пролиферирующего опухолевого клона, поскольку при ремиссиях острых лейкозов уровни ферритинов приближаются к нормальным величинам. Снижение уровня гликозилированных форм ферритина, возможно, обусловлено также нарушением процессов клеточного метаболизма и апоптоза при онкогематологических заболеваниях.
Данные о содержании L- и Н-изоформ ферритина, а также их гликозилированных и негликозилированных форм могут быть использованы для целей прогноза и мониторинга терапии при заболеваниях крови.
Область применения: онкология, гематология, клиническая лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: в научных исследованиях и для диагностики и прогнозирования течения лейкозов и анемий.
Предложения по сотрудничеству: совместные работы по оценке уровня ферритина и его гликозилированных и негликозилированных форм в сыворотке крови человека.