По состоянию на 01.01.2009 г. в Республике Беларусь зарегистрировано 198955 человек, страдаю­щих сахарным диабетом, из них 14999 страдают инсу­линозависимой формой данной патологии (сахарным диабетом 1-го типа). В настоящее время ключевым способом контроля уровня глюкозы у пациентов с са­харным диабетом I типа является заместительная ин­сулинотерапия. Как один из путей повышения эффек­тивности лечения сахарного диабета I типа и качества жизни пациентов рассматривается клеточная регенера­ционная терапия и генная терапия ex vivo. МСК различ­ного происхождения являются клетками, пригодными для экспериментальной разработки и последующего использования на практике методов регенеративной медицины при лечении сахарного диабета I типа, что обусловлено несколькими причинами. Современные технологии позволяют получать МСК непосредственно из тканей пациента, что решает проблему гистонесов­местимости. С помощью растворимых факторов или через генетическую модификацию МСК могут быть дифференцированы in vitro в инсулин-продуцирующие ?-клетки. МСК, выступая в роли клеточных векторов, могут обеспечивать адресную доставку гена препроин­сулина (ППИ) в поджелудочную железу при проведе­нии генной терапии ex vivo.

Цель исследования: разработать лентивирусную век­торную систему доставки гена ППИ в МСК человека, которая обеспечила бы стабильную продукцию гормона in vitro.

С помощью лентивирусной трансдукции прове­дена успешная генетическая модификация МСК би­цистронными экспрессионными кассетами, кодирую­щими природный ППИ человека и его модификацию одноцепочечный преинсулин и репортерный белок eGFP.

Нами была построена биоинформационная модель гена природного ППИ человека. Кодирующая область гена имеет размер 1120 п. о. и представлена двумя эк­зонами, которые разделены интроном протяженностью 787 п.о.

ПЦР показала, что МСК человека экспрессируют гены трех из пяти необходимых для процессинга ППИ протеаз: CPE, SCG5(7B2) и FUR. Ключевые же прогор­монконвертазы - PCSK1 и PCSK2, обеспечивающие образование из проинсулина зрелой формы инсулина, в МСК не экспрессируются. Эти результаты были учте­ны при проектировании нуклеотидной последователь­ности, кодирующей ППИ дикого типа или модифици­рованную форму инсулина.

Методом ПЦР с перекрывающимися олигонуклео­тидами были синтезированы нуклеотидные последо­вательности, кодирующие природный ППИ и одно­цепочечный преинсулин (форма ППИ, не требующая вырезания С-пептида) человека.

На базе лентивирусного вектора доставки pHR-SINcPPT-SIEW были созданы два новых бицистрон­ных лентивирусных вектора доставки: кодирующий природный ППИ человека вектор pHR-hPPI и коди­рующий одноцепочечный преинсулин человека вектор pHR-hSCI. Каждый из векторов содержал в себе после­довательность репортерного гена eGFP, объединенную в единую рамку считывания с целевым геном посред­ством IRES (внутренний сайт посадки рибосом - internal ribosomal entry site) вируса энцефаломиелокар­дита.

С помощью лентивирусной трансдукции была про­ведена успешная генетическая модификация МСК векторами pHR-hPPI и pHR-hSCI . Эффективность мо­дификации определяли методом проточной цитометрии по экспрессии репортерного белка eGFP. В результате модификации МСК вектором pHR-hPPI эффективность трансдукции при использовании множественности инфекции (МИ) 5 составила 68,6%; МИ 10-78,5%. Эф­фективность трансдукции МСК вектором pHR-hSCI составила 57,7 и 68,4% при МИ 5 и 10 соответственно. Не было обнаружено достоверного уменьшения содер­жания модифицированных клеток по истечении всего периода культивирования (24 сут).

Экспрессию целевых генов подтверждали методом ПЦР в реальном времени. При использовании ленти­вирусного вектора pHR-hPPI содержание мРНК ППИ увеличивалось в 20-50 раз по отношению к контроль­ным клеткам, вектора pHR-hSCI - увеличивалось до 200-300. При этом в обоих случаях экспрессия целево­го гена была значительно ниже таковой в клетках под­желудочной железы, оставаясь, тем не менее, стабиль­ной на протяжении 24 сут.

Таким образом, авторами были разработаны два лентивирусных вектора, кодирующие гены природного ППИ и его модификации, одноцепочечного преинсули­на. Показана высокая и стабильная эктопическая экс­прессия трансгенов в генетически модифицированных МСК.