УДК: 616.99:579.887.1-07:57.088.7
Год издания: 2012

Количественная оценка уровня ДНК Mycoplasma genitaliumв биологическом материале пациентов

Костюк С.А.Полещук Н.Н.Руденкова Т.В.Рубаник Л.В.Бадыгина Н.А.Полуян О.С.Глинкина Т.В.
Рубрики: 76.29.4876.35.33
Белорусская медицинская академия последипломного образования
Тема НИР: «Разработать лечебную тактику ведения беременных с инфекциями урогенитального тракта, обусловленными Mycoplasma genitalium, с учетом молекулярно-биологических особенностей возбудителя»
Сроки выполнения НИР: 01.01.2011 г. — 31.12.2013 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. С.А. Костюк
Источник финансирования: госбюджет.

Определение количественного уровня ДНК возбудителя в биологическом материале пациентов является одним из ключевых моментов при выборе врачом лечебной тактики, а при ведении беременных может служить критерием, определяющим степень риска инфицирования новорожденных во время родов.

Цель: разработка калибратора ДНК M. genitalium для проведения количественного анализа ДНК возбудителя в биологическом материале пациентов.

Для количественного анализа ДНК M. genitaliumв биологическом материале пациентов был разработан калибратор, содержащий ДНК возбудителя и ДНК человека в концентрациях от 10 2 до 10 4 копий/мл. Количественное определение ДНК M. genitalium проводилось по детекции однокопийного гена gap. При этом были использованы специально подобранные пары праймеров и зонд, которые были выбраны из нуклеотидной последовательности gap-гена с использованием Vector NTI программного обеспечения: forward-праймер — 5′-GTG CTC GTG CTG CAG CTG T-3′; reverse-праймер — 5′-GCT TGA TTT ACT TGT TCA ACA GAT GGA C-3′; TaqMan олигонуклеотидный зонд — 5′-(FAM) TGT TGT TCC AGA AGC AAA TGG CAA ACT T (TAMRA)-3′.

В качестве внутреннего контроля был выбран ген человека NAGK. ДНК человека выделяли из лейкоцитов периферической крови (Blood&Tissue Purification kit, Qiagen).

Для проведения амплификации был оптимизирован состав смеси и соответствующая программа. В каждую пробирку объемом 0,2 мл добавляли 30 мкл амплификационной смеси: 5 мкл деионизованной воды, 20 мкл Quick load 2x Taq Master Mix и 5 мкл смеси, содержащей 25 рмоль/мкл каждого праймера и TagMan-зонда. В пробирку вносили по 10 мкл анализируемого образца, а в пробирку отрицательного контроля — 10 мкл деионизированной воды. Амплификацию проводили с использованием термоциклера «Rotor-Gene-6000» («Corbett research», Австралия) по следующей программе: 95°С — 10 мин; 45 циклов: 95°С — 15 с, 55°С — 8 с, 72°С — 12 с.

Стандартизацию панели разведений ДНК M. genitalium проводили с использованием калибровочного референсного материала плазмидной ДНК. Оценка панели разведений ДНК M. genitaliumпроводилась с использованием аналитического показателя — коэффициента вариации.

При анализе данных определения коэффициента вариации для образцов панели разведений ДНК M. genitaliumбыло показано, что все значения коэффициента вариации были меньше приемлемых 20%, что позволило использовать полученную панель в концентрациях 10 4 копий/мл, 10 3 копий/мл, 10 2 копий/мл в калибраторе M. genitalium.

Для формирования калибратора ДНК M. genitalium смешивали соответствующие концентрации стандартизированной панели разведений ДНК M. genitaliumи панели разведений ДНК NAGK гена человека. Таким образом, калибратор M. genitaliumсодержал 3 образца: калибратор M.G. 4: 10 4 копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 4 ко-пий/мл ДНК NAGK гена человека; калибратор M.G. 3: 10 3 копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 3 копий/мл ДНК NAGK гена человека; калибратор M.G. 2: 10 2 копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 2 копий/мл ДНК NAGK гена человека.

Для апробации сформированного калибратора M. genitalium проводилось определение концентраций плазмид pMGgap и pHUMANnagk, причем образцы плазмиды pMGgap в концентрациях 5?10 4 , 5?10 3 , 5?10 2 копий/мл и образцы плазмиды pHUMANnagk в концентрациях 5?10 4 , 5?10 3 , 5?10 2 копий/мл использовали в качестве образцов, концентрация которых определялась с помощью калибратора.

Количественная ПЦР-РВ проводилась в мультиплексном формате, т.к. в каждой пробирке одновременно присутствовали 2 пары специфичных праймеров, 2 типа зондов для гена gap M. genitalium и для гена NAGK человека.

Оценка калибратора M. genitalium проводилась с использованием аналитического показателя — коэффициент вариации. При анализе полученных данных определения коэффициента вариации для образцов калибратора M. genitaliumбыло показано, что все значения коэффициента вариации меньше приемлемого значения 20%, что позволило использовать полученный калибратор для определения концентрации M. genitaliumв биологическом материале.


Область применения: клиническая лабораторная диагностика, акушерство и гинекология, урология, дерматовенерология.
Рекомендации по использованию: разработанный калибратор можно применять для определения уровня ДНК M. genitalium в биологическом материале пациентов (женщин, мужчин, детей), а также для научно-исследовательских целей.
Предложения по сотрудничеству: консультативная и практическая помощь в отработке методики количественной ПЦР в режиме реального времени по количественному определению ДНК M. genitaliumв биологическом материале пациентов.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта