Определение количественного уровня ДНК возбудителя в биологическом материале пациентов является одним из ключевых моментов при выборе врачом лечебной тактики, а при ведении беременных может служить критерием, определяющим степень риска инфицирования новорожденных во время родов.

Цель: разработка калибратора ДНК M. genitalium для проведения количественного анализа ДНК возбудителя в биологическом материале пациентов.

Для количественного анализа ДНК M. genitaliumв биологическом материале пациентов был разработан калибратор, содержащий ДНК возбудителя и ДНК человека в концентрациях от 10 ² до 10 ⁴ копий/мл. Количественное определение ДНК M. genitalium проводилось по детекции однокопийного гена gap. При этом были использованы специально подобранные пары праймеров и зонд, которые были выбраны из нуклеотидной последовательности gap-гена с использованием Vector NTI программного обеспечения: forward-праймер — 5′-GTG CTC GTG CTG CAG CTG T-3′; reverse-праймер — 5′-GCT TGA TTT ACT TGT TCA ACA GAT GGA C-3′; TaqMan олигонуклеотидный зонд — 5′-(FAM) TGT TGT TCC AGA AGC AAA TGG CAA ACT T (TAMRA)-3′.

В качестве внутреннего контроля был выбран ген человека NAGK. ДНК человека выделяли из лейкоцитов периферической крови (Blood&Tissue Purification kit, Qiagen).

Для проведения амплификации был оптимизирован состав смеси и соответствующая программа. В каждую пробирку объемом 0,2 мл добавляли 30 мкл амплификационной смеси: 5 мкл деионизованной воды, 20 мкл Quick load 2x Taq Master Mix и 5 мкл смеси, содержащей 25 рмоль/мкл каждого праймера и TagMan-зонда. В пробирку вносили по 10 мкл анализируемого образца, а в пробирку отрицательного контроля — 10 мкл деионизированной воды. Амплификацию проводили с использованием термоциклера «Rotor-Gene-6000» («Corbett research», Австралия) по следующей программе: 95°С — 10 мин; 45 циклов: 95°С — 15 с, 55°С — 8 с, 72°С — 12 с.

Стандартизацию панели разведений ДНК M. genitalium проводили с использованием калибровочного референсного материала плазмидной ДНК. Оценка панели разведений ДНК M. genitaliumпроводилась с использованием аналитического показателя — коэффициента вариации.

При анализе данных определения коэффициента вариации для образцов панели разведений ДНК M. genitaliumбыло показано, что все значения коэффициента вариации были меньше приемлемых 20%, что позволило использовать полученную панель в концентрациях 10 ⁴ копий/мл, 10 ³ копий/мл, 10 ² копий/мл в калибраторе M. genitalium.

Для формирования калибратора ДНК M. genitalium смешивали соответствующие концентрации стандартизированной панели разведений ДНК M. genitaliumи панели разведений ДНК NAGK гена человека. Таким образом, калибратор M. genitaliumсодержал 3 образца: калибратор M.G. 4: 10 ⁴ копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 ⁴ ко-пий/мл ДНК NAGK гена человека; калибратор M.G. 3: 10 ³ копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 ³ копий/мл ДНК NAGK гена человека; калибратор M.G. 2: 10 ² копий/мл ДНК M. genitaliumи 10 ² копий/мл ДНК NAGK гена человека.

Для апробации сформированного калибратора M. genitalium проводилось определение концентраций плазмид pMGgap и pHUMANnagk, причем образцы плазмиды pMGgap в концентрациях 5?10 ⁴ , 5?10 ³ , 5?10 ² копий/мл и образцы плазмиды pHUMANnagk в концентрациях 5?10 ⁴ , 5?10 ³ , 5?10 ² копий/мл использовали в качестве образцов, концентрация которых определялась с помощью калибратора.

Количественная ПЦР-РВ проводилась в мультиплексном формате, т.к. в каждой пробирке одновременно присутствовали 2 пары специфичных праймеров, 2 типа зондов для гена gap M. genitalium и для гена NAGK человека.

Оценка калибратора M. genitalium проводилась с использованием аналитического показателя — коэффициент вариации. При анализе полученных данных определения коэффициента вариации для образцов калибратора M. genitaliumбыло показано, что все значения коэффициента вариации меньше приемлемого значения 20%, что позволило использовать полученный калибратор для определения концентрации M. genitaliumв биологическом материале.