Цель: подобрать оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) для выявления точечной мутации T315I у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ).

Точечная мутация T315I (замена треонина на изолейцин) происходит в результате замены нуклеотида цитозина на тимин в 68721 положении гена ABL и вызывает развитие панрезистентности к препаратам группы ингибиторов тирозинкиназы. Данная мутация относится в группу наиболее часто встречаемых и может быть выявлена у пациентов с ХМЛ на всех стадиях заболевания. Наличие замены T315I эксперты Европейского общества по борьбе с лейкемией определили показанием к трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Так как успешность исхода ТГСК во многом зависит от стадии заболевания на момент ее проведения и наилучшие результаты достигаются в хронической фазе, раннее определение мутантного клона является актуальным вопросом современной медицины.

Основным методом выявления точечных мутаций является прямое секвенирование. К сожалению, чувствительность метода низкая (~20%), а его выполнение требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Нами были подобраны условия проведения метода ПЦР-ПДРФ, который с незначительными временными затратами позволяет выявить мутацию T315I и может быть воспроизведен в любой ПЦР лаборатории.

Амплификацию участка гена ABL проводили с помощью стандартной ПЦР. Последовательность праймеров F-ABL DNA, R-ABL DNA подбирали программой «Primer-BLAST» и синтезировали в компании «Праймтех» (Беларусь). ПЦР проводили при помощи реактивов фирмы «Fermentas» (Литва). Оптимальные условия проведения ПЦР определяли эмпирически. При подборе рестриктазы опирались на литературные данные, а также использовали программу Neb Cutter v.2.0. В исследования была включена рестриктаза TspRI (TscaI).

Для исследований использовали ДНК, полученную от пациентов с ХМЛ в различных фазах заболевания и от пациентов без гематологических заболеваний в анамнезе, не предъявляющих жалоб, указывающих на гематологическую патологию, и без изменений в общем анализе крови.

В качестве контрольных образцов использовали искусственно синтезированные ампликоны с мутантной и дикой нуклеотидной последовательностью. Синтез проводили самостоятельно при помощи ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green, нуклеотидную последовательность подтверждали методом прямого секвенирования. Из контрольных образцов готовили серию разведений с долей мутантной нуклеотидной последовательности 10; 20; 30; 40 и 50%. В последующем образцы с различной концентрацией мутантного ампликона исследовали методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы TspRI (TscaI). На фореграмме ампликон с нуклеотидной последовательностью дикого типа отображен в виде зоны с молекулярной массой 159 п.н., а мутантного типа — 162 п.н. На рис. представлена фореграмма проведения ПЦР-ПДРФ искусственно синтезированных контрольных мутантных образцов с различным разведением с использованием рестриктазы TscаI.

Таким образом, по предварительно полученным нами данным при использовании метода ПЦР-ПДРФ предположить замену T315I в образце можно при наличии мутантной нуклеотидной последовательности в образце не менее 30%.

Данная методика может быть рекомендована для применения в организациях здравоохранения, проводящих диагностику и мониторинг терапии пациентов с ХМЛ молекулярными методами.