Резистентность к фторхинолонам среди мно-жественно лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis резко ограничивает возможность лечения туберкулеза и уменьшает шанс на успех терапии. Ранняя диагностика резистентности к фторхинолонам позволяет своевременно скорректировать терапию и имеет ключевое значение в лечении мультирезистентного туберкулеза.

Определение спектра резистентности к противотуберкулезным лекарственным средствам (ПТЛС) с использованием классических методов занимает до 3 мес., что диктует необходимость разработки методов экспресс-диагностики лекарственно-устойчивых M. tuberculosis. У 60–90% изолятов M. tuberculosis устойчивость к фторхинолонам связана с мутациями в кодонах 90, 91, 94 гена gyrA, что позволяет рассматривать их как маркеры резистентности к фторхинолонам.

Цель:разработка метода молекулярной экспресс-идентификации устойчивости M. tuberculosisк противотуберкулезным лекарственным средствам резервного ряда — фторхинолонам.

Кодон гена 90 gyrA M. tuberculosis(код доступа к сиквенсу gyrAгена M. tuberculosis H37Rv— NC_000962.2, GenBalnk, NCBI) характеризуется присутствием gcg в положениях 268, 269, 270 соответственно. Мутация в этом кодоне, ассоциированная с устойчивостью к фторхинолонам, происходит в положении 269 и сопровождается заменой gcg на gtg. Для выявления мутации в кодоне 90 гена gyrA нами разработан метод ПЦР в реальном времени с системой двойного рас-познавания, когда в каждый образец реакционной смеси вносят два праймера (прямой GYR-F-200/218 5-ACCGCAGCCACGCCAAGTC-3 и обратный GYR-R-358/339 5-CTGGCGAGCCGAAGTTGCC-3), два зонда, один из которых специфически взаимодействует с мутантным типом кодона и мечен R6G, а второй специфически взаимодействует с диким (немутированным) типом кодона и мечен FAM. В пробах с M. tuberculosis, имеющими мутации в кодоне 90 гена gyrA, регистрируется флюоресценция выше пороговой для R6G-зонда (возбуждение — 492 нм, экстинкция — 517 нм), в то время как FAM-зонд к «дикому» типу (возбуждение — 520 нм, экстинкция — 548 нм) не флюоресцирует. В пробах с M. tuberculosis, не имеющих мутации, флюоресцирует FAM-зонд к «дикому» типу, в то время как R6G-зонд к «мутантному» типу не флюоресцирует.

Определение флюоресценции проводят для проб исследуемой ДНК, для положительных контрольных образцов, отрицательных контрольных образцов, фона. Для выявления точечных мутаций в кодоне 90 гена gyrA M. tuberculosis используют уникальные последовательности праймеров, амплифицирующих gyrA ген, и уникальные последовательности зондов, специфичных к «дикому» (gcg) и мутантному (gtg) кодону 90 гена gyrA. В реакционные смеси введены присадки, которые оптимизируют ПЦР и повышают ее чувствительность и специфичность. Примеры получаемых результатов и их интерпретация с использованием данного способа приведена на рис. 1.

С целью подтверждения присутствия мутации, сопровождающейся заменой цитозина на тимин в по-ложении 269 гена gyrA M. Tuberculosis, проводили рестрикцию с помощью BstUI cg|cg ампликона гена gyrA размером 320 п.о., получаемых с помощью пар праймеров 320-gyr-F-cagctacatcgactatgcga и 320-gyr-Rgggctncggtgtacctcat. Появление мутации в положении 269 гена gyrAприводит к исчезновению сайта рестрикции BstUI cg|cg, что сопровождается изменением профиля образуемых рестрикционных фрагментов (рис.2).

Культуру микобактерий с мутацией в кодоне 90, вы-явленной в ПЦР в реальном времени и подтвержден-ной в рестрикционном анализе, следует считать устойчивой к фторхинолонам.

Сравнение результатов секвенирования с результатами разработанного метода показало эффективность пследнего в выявлении мутаций gcg/gtg в 269 нуклеотиде кодона 90 гена gyrA.

Таким образом, разработанный метод направлен на выявление замены нуклеотидов gcg–gtg, происходящей в 269 нуклеотиде кодона 90 гена gyrA, что позволяет проводить раннюю диагностику устойчивости к фторхинолонам у M. tuberculosis. Метод предполагает проведение следующих стадий: 1) выделение стандартным способом ДНК из образцов диагностического материала или чистых культур микобактерий; 2) проведение ПЦР в реальном времени с парными зондами для выявления мутаций в кодоне 90 гена gyrA; 3) подтверждение присутствия мутации с использованием рестрикции ампликона гена gyrAразмером 320 п.о. ферментом BstUI cg|cg. В работе использованы новые последовательности зондов и праймеров.