Цель:разработка тест-системы молекулярной экспресс-идентификации лекарственной устойчивости M.tuberculosis (МБТ) к противотуберкулезным лекарственным средствам (ПТЛС) резервного ряда (фторхи-нолонам).

Материалом для исследования были клинические изоляты микобактерий туберкулеза, выделенные из образцов мокроты пациентов с туберкулезом органов дыхания, предварительно разжиженной и деконтаминированной в соответствии со стандартными методиками.

Рост туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) в современных условиях в Республике Беларусь заставил обратить особое внимание на лекарственные средства группы фторхинолонов как на наиболее эффективные ПТЛС резервного ряда. Однако широкое применение для лечения МЛУ туберкулеза фторхинолонов привело к появлению и очень быстрому нарастанию устойчивости МБТ к этой группе ПТЛС. Во всем мире, в т. ч. в Республике Беларусь, стала диагностироваться так называемая широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ), которая характеризуется сочетанием множественной лекарственной устойчивости с устойчивостью к фторхинолонам и любому из инъекционных ПТЛС резервного ряда (амикацин, канамицин, капреомицин). Резистентность к фторхинолонам МЛУ штаммов МБТ резко ограничи-вает возможность лечения и уменьшает шанс на успех терапии.

Точная и быстрая диагностика лекарственной устойчивости к фторхинолонам имеет не только ключевое значение в лечении МЛУ-ТБ, но и уменьшает риск возникновения и распространения ШЛУ-ТБ.

Впервые проведен анализ результатов определения лекарственной чувствительности 1277 клинических изолятов МБТ, выделенных в различных регионах Республики Беларусь от вновь выявленных и бактериоскопически подтвержденных случаев ТБ, зарегистрированных для лечения в 2009–2010 гг.

Установлена высокая частота устойчивости МБТ к ПТЛС резервного ряда — фторхинолонам (офлоксацину) — среди вновь выявленных (5,4%) и ранее пролеченных (21,1%) пациентов. В целом 15,8% пациентов в Республике Беларусь выделяют МБТ, устойчивые к фторхинолонам.

Было доказано, что приобретенная резистентность к фторхинолонам в основном обусловлена мутациями в особых регионах генетических мишеней, активирующих ферменты. Устойчивость к фторхинолонам обу-словлена мутациями в небольшом 21 п.о. фрагменте, называемом QRDR — детерминантный регион устойчивости к фторхинолонам, как правило, мутации локализуются в кодонах 90, 91 и 94 гена gyrA.

Проведен in silico анализ гена gyrA. С помощью разработанных праймеров и режимов амплификации gyrA–Вполучены ампликоны размером 1200 п.о. 19 клинических изолятов, проведено их секвенирование, определены кодоны (90, 91, 94), для которых будет разработан метод экспресс-выявления мутаций, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам. Секвенированные по gyrAгену культуры МБТ будут использованы в качестве контролей в разработке метода ПЦР в реальном времени для детекции устойчивости к фторхинолонам.

Для выявления полиморфизма во фрагменте размером 21 п.о. гена gyrA с помощью ПЦР в реальном времени были отобраны праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагментов и ампликоны размером 150–190 п.о. без образования видимых на электрофорезе неспецифических фрагментов и димеров праймеров.

С использованием разработанных праймеров и температурных параметров проведена амплификация гена gyrA5 клинических изолятов микобактерий туберкуле-за. Ампликоны гена gyrA образовывали полосу в области молекул с массой 150–190 п.о. у всех исследованных штаммов.