Методы клеточной терапии, интенсивно разрабатываемые в последнее десятилетие, требуют поиска эффективных методов наращивания стволовых клеток. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в настоящее время являются наиболее востребованными для клинического применения. Получение в достаточных количествах МСК из костного мозга или жировой ткани человека зависит от факторов культивирования in vitro. Как правило, для наращивания МСК применяют различные питательные среды с добавлением бычьей или телячьей сыворотки, ростовых факторов, меркаптоэтанола. Использование сыворотки животных при культивировании МСК для клинического применения в настоящее время ограничивается риском передачи прионной болезни, что привело к запрету использования сыворотки крупного рогатого скота для этих целей в ряде стран. Это потребовало использования специаль-ных дорогостоящих бессывороточных сред либо аутологичной или аллогенной сыворотки человека.

Цель:оценка эффективности получения трансплан-тата МСК костного мозга человека с использованием сыворотки АВ (IV), приготовленной из донорской крови в ГУ «РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий».

Разработана методика наращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека для клинических целей с использованием сыворотки АВ (IV).

Приготовление реагента включало получение сыворотки из крови 5–10 здоровых доноров АВ (IV) группы крови, ее объединения (пулирование), стерилизующей фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Полученную сыворотку АВ (IV) замораживали и хранили до использования при -20°С в течение года. Приготовленную сыворотку АВ (IV) контролировали на микробиологическую стерильность и дополнительно на отсутствие возбудителей вирусных гепатитов В, С, вируса иммунодефицита человека в ПЦР.

Биологическую эффективность сыворотки АВ (IV) оценивали по увеличению количества МСК из 3-х об-разцов костного мозга человека при культивировании в питательной среде ?-МЕМ со значениями теста колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) 4,2; 11,3; 15,2. Общая продолжительность наращивания МСК, включая этап получения первичной культуры и 3 пассажа культивирования, составила в среднем 29 дней. За этот период было получено от 4,8 до 12,2 млн клеток из 1 мл костномозгового пунктата при кратности увеличения количества клеток в среднем в 2,5?10 4 раза. Образцы костного мозга различались между со-бой по относительному и абсолютному содержанию предшественников МСК, а также по их способности к пролиферации (табл.).

Сравнительные исследования показали, что количество МСК при культивировании в среде ?-МЕМ с 5% сыворотки АВ (IV) в среднем в 1,3 раза выше по сравнению с использованием 10% эмбриональной те-лячьей сыворотки (ЭТС). При одинаковом стартовом количестве клеток в лунке 24-луночного планшета (4,6?10 ₃ ) за 7 дней культивирования было получено 11,5±0,5?10 ₃ МСК при наращивании с cывороткой АВ (IV) и 8,9±0,7?103 МСК при наращивании с ЭТС (Р=0,049). Известно, что использование 10% ЭТС для наращивания МСК костного мозга позволяет увеличить количество клеток за 4–5 пассажей в 10 ₄ –10 ₅ раз.

При этом МСК в культуре могут пролиферировать до 19 удвоений, не теряя способности к пролиферации и дифференцировке, то есть из одного биоптата костного мозга можно выделить около 100 тыс. очищенных МСК, которые за счет пассажей удается нарастить до 500 млн МСК. В наших экспериментах число удвоений не достигло максимального значения, т. е. клетки сохраняли свой пролиферативный потенциал для дальнейшего наращивания.

Исследования показали, что метод культивирования in vitro МСК костного мозга человека в питательной среде ?-МЕМ с 5% сыворотки АВ (IV) эффективен и может быть использован для наращивания МСК в больших объемах для клинического применения.