Цель:разработать методику оценки лекарственной чув-ствительности гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).

Сущность достижения заключается в том, что лекарственная чувствительность ГСК оценивается как показатель апоптоза CD34+ в популяции мононуклеаров после контакта клеток с лекарственными средствами в установленных предварительно концентрациях.

Для исследования использовали образцы клеток, выделенных из периферической крови и предназначенных для аутологичной трансплантации пациентам с множественной миеломой, а также образцы клеток донорского костного мозга, предназначенного для аллогенной трансплантации.

При необходимости предварительно выделяли мононуклеары путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 г/мл (Sigma) по стандартной методике. После лизиса остаточных эри-троцитов клетки культивировали в течение 24 ч без лекарственных средств и с различными лекарственными средствами в среде RPMI 1640 с добавлением 10% ЭТС. Фенотип и состояние клеток оценивали по связыванию антител к CD34-FITC, аннексинаV-PE и внутриклеточному проникновению 7-AAD.

После культивирования клетки отмывали от среды и оценивали содержание жизнеспособных ГСК (CD34+, не связавшие AnV- и 7-AAD-). Клетки, связавшие ан-нексин V, рассматривали как клетки на ранних стадиях апоптоза, тогда как клетки, связавшие 7-AAD, относили к клеткам на поздней стадии гибели. Записывали не менее 100 000 событий. Анализ данных осуществляли с использованием программы CellQuestPro. Наблюда-ли значительную индивидуальную вариацию чувствительности ГСК в образцах клеток ко всем изученным химиопрепаратам.

При анализе общего содержания и жизнеспособности CD34+-клеток выявлено изменение их общего содержания под действием химиопрепаратов. Причем наблюдали как уменьшение, так и увеличение относительного содержания CD34+-клеток в общей популяции мононуклеаров.

Это объясняется тем, что на поздних стадиях клеточной гибели происходит значительное изменение параметров светорассеивания и утрата поверхностных антигенов. Уменьшение содержания CD34+-клеток, по-видимому, связано с утратой поверхностных антигенов на поздних стадиях клеточной гибели.

Увеличение содержания CD34+-клеток может быть следствием того, что остальные мононуклеарные клетки оказываются более чувствительными к исследуемому лекарственному средству, чем ГСК. Так как общее содержание CD34+-клеток изменяется, доля клеток на стадии раннего и позднего апоптоза среди них не может отражать чувствительность клеток к химиопрепарату. Наиболее информативным показателем представляется доля жизнеспособных (AnV-\7-AAD-) CD34+-клеток в образце.

Определенный интерес представляет содержание CD34+-клеток в общей популяции мононуклеаров как самостоятельный показатель. Если общее содержание стволовых клеток достаточно значительно коррелирует с содержанием жизнеспособных стволовых клеток, это может значительно удешевить процедуру анализа.

Для сравнения между собой данные нормирова-ны по контролю. Коэффициенты корреляции между общим содержанием CD34+ клеток и содержанием жизнеспособных CD34+-клеток составили 0,73 для дексаметазона; 0,96 для винкристина и 0,64 для мелфалана. Это свидетельствует о том, что общее содержание CD34+-клеток среди мононуклеаров через 24 ч культиви-рования с химиопрепаратами может быть показателем чувствительности ГСК к дексаметазону и винкристину.