Цель: получение цитруллинированного рекомбинантного белка — виментина, иммунохимически эквивалентного цитруллин-содержащему белку in vivo, выступающего одновременно в роли пускового фактора патогенеза и антигена-мишени для аутоантител к цитруллинированным пептидам, образующимся на ранних стадиях ревматоидного артрита (РА).

Сущность и новизна достижения заключается в получении рекомбинантного белка с заданной степенью структурной модификации и иммунохимическими свойствами методами генетической и белковой инженерии. Предшествующие исследования фокуси-ровались на выделенных природных белках либо на химически синтезированных цитруллин-содержащих пептидах как антигенах-мишенях аутоантител.

Обоснование исследования базируется на данных последних лет, показавших, что виментин как белок цитоскелета различных типов клеток, включая клетки мезенхимы и эндотелия, фибробласты, остеоциты, присутствует также в синовиальной жидкости сустава и является субстратом цитруллинирования — реакции дезамидирования остатков аргинина, происходящей в норме под действием фермента пептидиларгинин-деиминазы (PAD), но не приводящей к формированию аутоантител благодаря феномену иммунологической толерантности. Однако в случае срыва иммунологической толерантности под действием факторов генетической или иной природы приблизительно у 1% индивидуумов цитруллинирование индуцирует образование аутоантител и превращает виментин в триггер аутоиммунного процесса, инициирующего патогенез РА. В контексте этих событий, антитела к цитруллинированному виментину представляют собой диагностически значимый маркер раннего ревматоидного артрита, а сам цитруллинированный белок — один из основных инструментов диагностики.

Основой для создания плазмиды, кодирующей рекомбинантный виментин, послужил вектор pET-22b (Novagen, США). Ген, кодирующий виментин человека (1-466 а.к.), амплифицировали, используя в качестве матрицы кДНК полноразмерного виментина человека, клонированную в «родительский» вектор pCMV6-XL5 (OriGene Technologies, США). Генно-инженерные операции по получению экспрессирующей плазмиды включали амплификацию гена, его перенос в клонирующий вектор pJET1/blunt, мутагенез в положениях 46 и 175 нуклеотидной последовательности, приводящий к замене аминокислотных остатков Gly-16 и Gly-59 на остатки Arg, клонирование мутированного гена в экспрессионный вектор pET-22b по сайтам рестрикции NdeI и NotI и контрольное секвенирование по Сэнгеру. Модификация структуры виментина путем введения дополнительных остатков аргинина повторяет мутагенез, обнаруженный in vivo для виментина из синовиальной жидкости пациентов с РА, и обеспечивает антигенную компетентность белка в реакции с аутоантителами-маркерами раннего РА. Полученная генная конструкция при трансляции дает полипептид с молекулярной массой ~54 кДа, что соответствует мутированному виментину человека с метионином на N-конце и дополнительным гексагистидиновым пептидом (His6) на С-конце.

Экспрессия модифицированного виментина осуществлена в клетках E.coliштамма BL21(DE3) в условиях индукции изопропил-?-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ, 1 мМ). Уровень экспрессии в типичном случае составляет около 70 мг белка на 1 литр культуральной среды. Целевой белок локализован преимущественно в тельцах включения, где составляет 60–80% суммарного белка.

Разработан эффективный метод ренатурации (рефолдинга) и хроматографической очистки белка на металл-хелатном сорбенте Ni-NTA-сеферозе. Виментин солюбилизировали из телец включения в 6М гуанидин гидрохлориде и наносили на колонку с Ni-NTA-сефарозой. После промывки и смены денатуранта на 8М мочевину белок либо элюировали в денатурирующих условиях в буфере, содержащем 0,2М имидазола, и ренатурировали с помощью градиентного или ступенчатого уменьшения концентрации денатуранта, либо непосредственно на колонке проводили рефолдинг в нисходящем градиенте концентрации мочевины и далее элюировали виментин в нативных условиях буфером, содержащем 0,2М имидазол. В результате получен препарат модифицированного виментина с чистотой не менее 95% по данным электрофореза в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия. Флуоресцентная спектроскопия указывает на компактную нативную конформацию белка с основными флуорофорами, экранированными от контакта с растворителем.

Мутированную форму рекомбинантного виментина человека цитруллинировали in vitro с помощью фермента PAD. Учитывая ограниченную доступность и высокую стоимость коммерческих препаратов фермента и исходя из направленности работы на создание миними-зированной по импортной составляющей технологии получения цитруллинированных белков и диагности-ческих наборов, нами разработан метод выделения PAD из скелетных мышц кролика и оптимизированы условия его применения. Ферментативная модификация виментина проведена при рН 8,0 в объеме 0,9 мл буферного раствора, содержащего 1 мг PAD и 0,35 мг виментина, 8 мМ CaCl ₂ , 0,5 мМ дитиотреитола в тече-ние ночи при 37°С. Степень цитруллинирования белка определена по результатам окрашивания цитруллина с помощью 2,3 бутандион моноксима и антипирина в разбавленной (1:35) серной кислоте ранее описанным методом (Vassef A.A. et al., 1978), дающим окрашенный продукт, регистрируемый по поглощению при 464 нм. Степень цитруллинирования виментина, определенная по калибровочной кривой, в случае оптимизированных условий ферментативной реакции достигала максимального значения 18,3%, что соответствует данным, ранее полученным для белка, выделенного из синовиальной жидкости. При такой эффективности цитруллинирования в среднем 8 из 45 остатков аргинина в мутированном рекомбинантном виментине трансформированы в цитруллин. Установлено, что условиями достижения максимальной степени ферментативного цитруллинирования является инкубация образцов виментина с ферментом при 37°С в течение ночи при pH 7,4 и молярном соотношении фермент–виментин, равном 5:3. Учитывая невысокую каталитическую активность фермента как его структурно детерминированное свойство и, как следствие, необходимое высокое молярное содержание фермента, его отделение после ферментативной трансформации проведено с помощью хроматографии на Ni-NTA-сефарозе, используя введенный в структуру белка C-концевой His6 пептид.

В результате комбинации методов генетической и белковой инженерии получен цитруллинированный виментин как основной компонент иммунохимических систем для количественного определения аутоантител-маркеров раннего ревматоидного артрита. После детального анализа иммунохимических параметров белка и оптимизации конструкции твердофазного антигена в реакции с аутоиммунными иммуноглобулинами сыворотки крови лиц с ревматоидным артритом различной стадии прогрессии полученный белок будет использован как основной реагент лабораторных тест-систем и макетных образцов иммуноферментного диагностического набора, технологическая разработка и производство которого планируется в ГУ «РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий».